论文摘要
文昌鱼是现存的与脊椎动物原始祖先最接近的头索动物,一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的模式动物。文昌鱼的基因序列和表达模式已经被广泛用于不同物种之间的比较基因组学研究和发育同源性分析。载脂蛋白D（ApoD）属于脂蛋白家族,和该家族的其它成员一样,其基本功能是转运一些脂类的小分子物质,还参与胚胎的发育、分化;肿瘤细胞的发生、发展和凋亡;免疫性反应;抵抗外界环境胁迫以及神经系统的发生和损伤修复。目前,对ApoD的研究主要集中在基因表达、组织分布和生理功能上,对其包括调控区在内的基因组结构分析相对较少,而这对于深入阐明ApoD功能及其基因表达调控具有重要意义。本文首先从生物信息学角度对分属于原生动物、无脊椎动物（包括原口和后口动物）、头索动物和脊椎动物类群的10种动物ApoD的基因结构及调控区的调控元件进行分析及比较,发现:（1）ApoD基因外显子-内含子结构从原生动物草履虫到原口动物再到后口动物海胆的进化过程中不保守,但在分析的几种脊椎动物中相当保守;（2）文昌鱼ApoD基因扮演从无脊椎动物到脊椎动物承上启下的角色,可能代表了脊椎动物ApoD基因原型;（3）四个半胱氨酸保守位点在后口动物中都存在,而在原口动物中只存在两个,原口、后口动物ApoD蛋白一级结构上的差异反映蛋白功能上可能也存在一定差别;（4）调控区大多数主要调控元件为不同动物共有,说明ApoD主要功能及其表达调控在进化中相当保守;（5）ApoD基因个别调控元件是随着物种进化而出现并开始发挥相关作用,如SF-1;还有一些调控元件在进化过程中还没有发现其规律,这说明ApoD某些功能和基因表达调控模式可能因物种不同而存在一定的差异。对鼠NIH/3T3纤维原细胞暴露在H2O2、UV等氧化压力条件下的研究显示,体内的ApoD表达量呈现出一种剂量依赖性的升高。有证据表明果蝇与ApoD同源的Glaz基因的大量表达会增强果蝇抗饥饿、抗氧化的能力并延长寿命。这些研究都表明ApoD蛋白很可能广泛参与体内的抗氧化过程。为了确定文昌鱼ApoD蛋白是否也具有抗氧化作用,我们构建了pET32a-BbApoD原核表达系统,成功地在大肠杆菌中得到了表达,并对体外重组蛋白的抗氧化活性进行了研究。体外清除羟自由基的抗氧化活性测定实验表明,在60μg/ml–420μg/ml剂量范围内,文昌鱼ApoD重组蛋白与Fenton体系产生的羟自由基的相互作用呈现浓度依赖性。当蛋白质量浓度为60μg/ml-180μg/ml时,对体系羟自由基的产生有促进作用,即抑制率为负值,但这种促进作用呈降低趋势;当蛋白质量浓度约为200μg/ml时,对羟自由基的生成开始产生抑制作用,并且随着浓度的升高,抑制率逐渐增大,可达45.28%,这说明重组蛋白在较高浓度时对自由基的清除作用非常明显。BbApoD重组蛋白对金属催化氧化（MCO）造成的DNA氧化损伤的保护作用结果表明,较高质量浓度的重组蛋白（≥100μg/ml）对氧化损伤导致的pUC19质粒的线性化有保护作用且逐渐增强,当重组蛋白质量浓度为200μg/ml时约有50%的质粒DNA保持超螺旋形式,而较低质量浓度时（≤50μg/ml）对pUC19没有保护作用,且质量浓度为25μg/ml时对质粒DNA的降解反而有促进作用。两组抗氧化实验结果都表明BbApoD重组蛋白在较低质量浓度时对体系自由基的产生有促进作用,较高质量浓度的重组蛋白才表现出抑制作用。目前,利用体外表达的ApoD蛋白直接测定其功能作用的研究还很缺乏,BbApoD重组蛋白对体外Fenton体系产生的羟自由基的抑制作用以及对DNA氧化损伤保护作用的浓度依赖性变化暗示了文昌鱼ApoD蛋白很可能也参与了体内的抗氧化过程。这是首次关于无脊椎动物体外重组蛋白具有抗氧化活性的报道,至于BbApoD重组蛋白的其它抗氧化活性,例如对脂质过氧化的保护作用还在进一步鉴定中,而文昌鱼ApoD蛋白体内的抗氧化机制也还有待于深一步的研究探索。