论文摘要
作为Ras蛋白超家族的一类小G蛋白,Rab蛋白参与细胞的内吞外排等蛋白转运过程,近年来发现某些Rab蛋白如Rab7与细胞的分化发育以及凋亡过程密切相关。Rab7b是我们自主发现的一个小G蛋白,与Rab7高度同源,定位于溶酶体,特异性的表达在髓系细胞,并与人白血病细胞分化相关。本研究中我们检测了Rab7b在人白血病K562细胞向巨核细胞分化过程中中不同阶段的表达水平,并将Rab7b及其突变体转染到K562细胞,从正反两方面探讨Rab7b在K562细胞向巨核细胞分化过程中的作用及可能的信号机制。首先我们用实时荧光定量PCR和Western blot检测PMA刺激K562细胞不同时相的细胞内Rab7b的表达变化,并用流式细胞仪检测细胞表面CD11b、CD14、CD33和CD41a的表达变化以鉴定K562细胞的分化方向。同时,我们构建了Rab7b、Rab7b的持续活化型突变（Rab7b-Q67L）、Rab7b的失活型突变（Rab7b-△CC）和Rab7b干扰（Rab7b-RNAi）质粒,转染到K562细胞,并用PMA刺激不同时间,检测细胞向巨核细胞分化的情况,包括显微镜观察细胞形态、CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况、ELISA检测IL-6的分泌水平、流式细胞仪检测细胞表面CD41a的表达和细胞周期的变化情况。由于PKC和ERK1/2两条信号途径在介导K562细胞向巨核细胞分化的过程中发挥着重要作用,我们用Western blot检测了PMA诱导不同时间后ERK1/2信号途径的活化情况。然后用抑制剂将PKC和ERK1/2途径阻断后再用PMA诱导不同时间,观察Rab7b的表达和K562细胞向巨核细胞的分化情况。由于PMA诱导的PKC和ERK1/2活化可能通过调节p21的表达和Rb磷酸化而调控K562的细胞周期和分化,因此我们检测了过表达或干扰Rab7b和抑制PKC、ERK1/2途径后P21的表达和Rb的磷酸化情况。研究发现,PMA刺激K562细胞后,Rab7b的表达水平显著增高,同时伴随CD41a表达的增高和CD33表达的降低,而CD11b和CD14的表达未受到显著影响。过表达Rab7b和Rab7b-Q67L的K562细胞用PMA刺激后向巨核细胞的分化增加,并伴随ERK1/2活化的增强;而过表达Rab7b-△CC或干扰K562细胞中的Rab7b分子后,细胞向巨核细胞的分化则受到抑制,同时ERK1/2的活化也降低。用BisⅠ阻断PKC信号通路后,再用PMA诱导K562细胞,则细胞内Rab7b的表达、细胞向巨核细胞的分化和ERK1/2途径的活化均受到抑制;而用U0126阻断ERK1/2信号通路后,PMA刺激则不能抑制细胞内Rab7b的表达,而细胞向巨核细胞的分化却受到抑制,说明Rab7b在介导K562细胞向巨核细胞分化的传导途径中。处于PKC的下游和ERK1/2的上游。另外,转染Rab7b和抑制PKC、ERK1/2途径都能够调节P21的表达和Rb的磷酸化,进一步证实了PKC/Rab7b/ERK1/2信号途径在PMA诱导K562细胞向巨核细胞分化过程中的作用。综上所述,我们自主发现的新型Rab蛋白—Rab7b能够促进PMA诱导的K562细胞向巨核细胞分化过程,并且认为PKC/Rab7b/ERK1/2信号途径的顺次活化介导了这个过程。本研究为Rab蛋白和白血病细胞分化和信号传导的关系提出了新的认识,为白血病细胞分化机制的分析提供了新的实验依据,有助于充实白血病细胞分化发育过程的理论,并将对白血病的预防、诊断及治疗等方面的研究起到极大的推动作用。