PLZF和DACH1的异常表达影响非小细胞肺癌发生与发展的分子机制

论文摘要

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,5年存活率小于15%,对人类健康和生命威胁极大。肺癌病因中除了吸烟是最重要的因素之外,细胞遗传物质的改变也是支气管上皮癌变的重要原因。遗传物质的改变主要涉及两大类与癌变相关的基因,某些癌基因的活化及抑癌基因的丢失或异常,它们与肺癌的发生、演变以及发展有密切关系。本研究选取了在肺癌中研究较少的两个抑癌基因—-PLZF和DACH1,探索它们与肺癌发生发展的关系。早幼粒细胞白血病锌指蛋白（Promyelocytic leukemia zinc finger protein, PLZF,又称ZBTB16）首次由上海血研所报道,由t（11；17）染色体易位后形成PLZF-RARa和RARa-PLZF融合基因造成早幼粒细胞白血病。PLZF是一个转录抑制因子,在造血细胞的生长分化、骨骼神经系统发育中起重要的调节作用。该基因的前期研究多集中在非实体瘤,近年来逐渐扩展到实体瘤中,而该基因在不同肿瘤中的具体作用存在差异。本研究首次在非小细胞肺癌样本中检测PLZF的表达并研究其功能。155对肺癌样本中PLZF mRNA在87.8%的样本中呈下调表达趋势（P<0.0001）,平均下降幅度达62.8%（95%CI=50.2%-75.3%）,且与肺癌患者的性别相关（P=0.029）。免疫组化结果验证了肺癌组织中PLZF蛋白的下调表达（P=0.0013）。TUNEL检测结果发现肺癌样本中凋亡减弱,提示PLZF与细胞凋亡相关。通过硫化测序PCR （Bisulfite sequencing PCR, BSP）检测发现肺癌细胞中PLZF启动子区CpG岛呈高甲基化状态,去甲基化实验进一步证明PLZF的mRNA表达由启动子区CpG岛甲基化调控。甲基化特异性PCR （Methylation specific PCR, MSP）检测表明,PLZF启动子区在36.8%的肺癌样本存在CpG岛的甲基化。在肺癌细胞中,过表达PLZF可以抑制细胞增殖,使细胞周期S期内细胞减少,并诱导细胞凋亡。由此可见,PLZF的异常表达与肺癌的发生发展有密切关系。Dachshund （Dac）最初是在一种表型为极短腿的果蝇突变体中发现的。Dac基因在调节眼部、四肢、大脑和性腺发育中起关键的作用。DACH1基因是dac基因在脊椎动物中的类似物之一。研究发现,DACH1在激素敏感型肿瘤中发生表达异常,且该基因可以调控激素依赖性信号通路。本研究在非小细胞肺癌样本中检测DACH1的表达并研究其与TGF-P信号通路的关系。DACH1在74.8%的肺癌样本中下调表达,下调幅度达50.1%（95%CI=34.3%-65.5%）（P<0.0001）。免疫组化结果提示DACH1的蛋白表达与肿瘤分类型相关（P=0.032）。对DACH1第一内含子上CpG岛的BSP检测并未发现甲基化信号。肺癌细胞中,随着外界TGF-β浓度的由低而高,DACH1的表达从上升转为下降。由此可见,DACH1的异常表达与肺癌的发生发展相关,而且可能受到TGF-β通路的调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 PLZF的表达变异与非小细胞肺癌发生的研究
• 第一章 PLZF在非小细胞肺癌中的异常表达
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器和设备
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 研究对象及样本采集
• 1.2.2 肺癌组织中PLZF mRNA表达检测
• 1.2.3 肺癌组织中PLZF蛋白表达检测
• 1.2.4 肺癌组织中的凋亡检测
• 1.3 结果
• 1.3.1 肺癌组织中PLZF mRNA表达下调且与病人的性别相关
• 1.3.2 肺癌组织中BIRC5 mRNA表达上调,凋亡下调
• 1.3.3 肺癌组织中PLZF蛋白表达下调
• 1.3.4 肺癌组织中凋亡受到抑制
• 第二章 PLZF启动子高甲基化导致其低表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器和设备与第一章中的相同。
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 研究对象
• 2.2.2 细胞和组织的DNA抽提
• 2.2.3 肺癌细胞的BSP检测和肺癌组织的MSP检测
• 2.2.4 A549细胞的去甲基化处理
• 2.2.5 统计学分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 肺癌细胞中PLZF启动子区高甲基化
• 2.3.2 细胞在5-aza-dC处理后PLZF启动子区去甲基化且表达显著上升
• 2.3.3 肺癌组织中PLZF启动子区高甲基化
• 第三章 肺癌细胞中PLZF过表达可抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要仪器和设备
• 3.1.2 主要耗材与试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 在多种肺癌细胞株中检测PLZF mRNA表达水平
• 3.2.2 PLZF的表达载体的构建
• 3.2.3 细胞转染
• 3.2.4 DAPI染色
• 3.2.5 Western Blot检测
• 3.2.6 细胞增殖的实时监控
• 3.2.7 细胞周期检测
• 3.2.8 细胞凋亡检测
• 3.2.9 统计学分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 PLZF在肺癌细胞系中低表达
• 3.3.2 PLZF在细胞核中表达
• 3.3.3 PLZF过表达抑制细胞增殖
• 3.3.4 PLZF过表达影响细胞周期
• 3.3.5 PLZF过表达诱导细胞凋亡
• 3.3.6 PLZF过表达并不影响CCNA2的表达水平
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 DACH1表达变异与非小细胞肺癌发生的研究
• 第一章 DACH1在非小细胞肺癌中异常表达
• 1.1 材料同第一部分中的1.1
• 1.2 方法
• 1.2.1 在肺癌组织中检测DACH1 mRNA表达
• 1.2.2 在肺癌组织中检测DACH1蛋白表达
• 1.3 结果
• 1.3.1 DACH1在肺癌组织中mRNA表达下调
• 1.3.2 DACH1在肺癌组织中蛋白表达与肿瘤分型相关
• 第二章 DACH1在肺癌中的甲基化
• 2.1 材料同第一部分2.1
• 2.2 方法
• 2.2.1 DACH1第一内含子区甲基化检测
• 2.3 结果
• 第三章 肺癌细胞中DACH1受TGF-β调控
• 3.1 材料（同第一部分的3.1）
• 3.2 方法
• 3.2.1 在多种肺癌细胞株中检测DACH1 mRNA表达水平
• 3.2.2 用不同浓度的TGF-β刺激A549细胞
• 3.3 结果
• 3.3.1 DACH1在肺癌细胞系中低表达
• 3.3.2 DACH1的表达随着TGF-P浓度增加受到抑制
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 总结与展望
• 致谢
• 发表论文