根癌农杆菌介导ipt基因转化甘蓝型油菜

论文摘要

油菜不仅是我国,同时也是世界上重要的经济作物和主要的食用油来源,是仅次于大豆的重要植物油脂的来源,也是当今世界上发展最快的多用途作物之一。目前,我国的油菜栽培面积、产量虽均居世界首位,但其单产却远远低于德国、丹麦等欧洲高产国家。近几十年来,随着人口的不断增加,环境的急剧恶化及耕地的逐渐减少,人口与土地之间的矛盾也日益加剧。因此,培育出超高产油菜成为当下我国油菜生产最主要的研究任务。但是由于常规的遗传改良育种方法所需的时间较长,工作量大,天然突变体难以发现,诱变育种具有不确定性,并且发展潜力也相当有限等因素,所以人们已经开始寻求其它能突破常规育种障碍的新技术。随着分子生物学的不断发展和转基因技术的日趋成熟,利用基因工程技术获得期望的优良作物品种已成为现阶段遗传改良工作者首选的育种途径。细胞分裂素能促进营养物质的定向运输,在种子和果实的发育过程中能促进坐果,影响果实和种子中同化物的积累,此外还具有促进胚乳的发育,以及具有增大果体的功能。因此利用基因工程手段,调控内源细胞分裂素含量,为进一步提高油菜产量提供了新的方向。本实验利用ipt基因（细胞分裂素合成关键酶基因）与Napin（油菜种子储藏蛋白）基因的启动子融合构建的、在种子发育时期,特异表达的ipt基因植物双元表达载体,介导油菜遗传转化,使得ipt基因在油菜种子的发育时期特异性高效表达,以期增加油菜种子形成时期内源细胞分裂素的含量,从而提高营养物质向种子定向运输的效率,为提高油菜的灌浆速度,进一步培育出超高产油菜种质奠定基础。研究的主要内容和结果如下：1、甘蓝型油菜无菌苗培养体系的建立种子洗去表面浮土和残种后,75%酒精洗涤45s-lmin,无菌水洗2-3次,0.1%HgCl2浸泡10min,无菌水洗5-6次,浸泡5h后,接种于种子发芽培养基：MS培养基+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.8,成苗率达100%,污染率为0（此处数据皆为以中双8号为实验材料时的数据）。2、以子叶和下胚轴为外植体的高频再生体系建立以苗龄4-7天的油菜子叶和下胚轴为外植体,接至分化培养基：MS+3mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂粉,pH5.8,可直接再生出芽,且再生频率达到100%；接至生根培养基：1/2MS+3%蔗糖+0.8%琼脂粉+0.2mg/LNAA,pH6.1,生根率亦达到100%。3、有效抑制子叶和下胚轴愈伤分化的筛选压浓度的确定将油菜无菌苗子叶和下胚轴分别接种到有不同PPT浓度的分化培养基中,并测试其对愈伤诱导所产生的抑制效果。结果发现,抑制油菜外植体愈伤分化的筛选压PPT浓度为15mg/L。4、根癌农杆菌介导的油菜遗传转化体系的建立油菜的最适转化条件：切取油菜无菌苗的带柄子叶,柄长0.1～0.2cm,下胚轴长约0.5cm,以OD600=0.3的农杆菌菌液感染子叶6～8min,下胚轴0.5～1min,暗培养3d后,用含500mg/LCef的MS液体培养基振荡脱菌,无菌水冲洗4-6次后,用无菌滤纸吸干其表面水分,然后接入延迟培养基上,延迟筛选6d后,转入分化筛选培养基上进行筛选,得到长约1-2cm左右的的芽时,将其切下接入生根培养基,待苗长至5-7cm且能正常生根时移栽,并对能够正常生根的抗性苗做进一步鉴定。5、转化植株组织化学检测及PCR检测剪取转化植株幼嫩部位的叶片,做GUS组织化学染色,43株抗性苗中,有18株的叶片,被染成蓝色,初步证明了外源基因已经插入到受体植物的基因组中；PCR检测结果显示,有11株扩增出与阳性对照相同的条带,进一步证明了外源基因已经成功整合至油菜基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 细胞分裂素研究概况
• 1.1.1 细胞分裂素的发现及其分布
• 1.1.2 细胞分裂素的分类
• 1.2 细胞分裂素的生理作用
• 1.2.1 细胞分裂素在植物生长过程中的作用
• 1.2.2 细胞分裂素在植株果实形成和种子发育中的主要生理功能
• 1.3 植物基因工程概况
• 1.4 油菜基因工程概况
• 1.4.1 基因工程在油菜品质改良方面的应用
• 1.4.2 基因工程在油菜抗性改良方面的应用
• 1.4.3 转基因油菜的安全性
• 1.5 ipt基因工程的研究概况
• 1.5.1 ipt基因简介
• 1.5.2 ipt基因工程和研究进展
• 1.6 本研究的研究背景、目的意义、主要内容和技术线路
• 1.6.1 研究背景和目的意义
• 1.6.2 研究的主要内容和技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 培养基及培养土
• 2.2 实验仪器
• 2.3 实验试剂及主要试剂的配法
• 2.3.1 组织培养培养基及主要添加成分的配法
• 2.3.2 细菌培养培养基及常用抗生素的配法
• 2.3.3 GUS组织化学染色的相关试剂配法
• 2.3.4 质粒提取、DNA提取和分子检测时相关试剂及其配法
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 无菌材料的准备
• 2.4.2 培养条件
• 2.4.3 子叶和下胚轴再生体系的建立及优化
• 2.4.4 重组质粒pCAMBIA3301-ipt转化农杆菌LBA4404的PCR验证
• 2.4.5 根癌农杆菌介导的遗传转化体系的建立
• 2.4.6 转化植株的生根与移栽
• 2.4.7 转基因植株的Gus组织化学检测
• 2.4.8 转基因植株的PCR检测
• 3 结果与分析
• 3.1 影响种子消毒的因素
• 3.1.1 种子预浸泡处理对升汞消毒效果的影响
• 3.1.2 最适消毒液和消毒时间的选择
• 3.2 子叶柄下胚轴芽再生过程中PPT浓度的确定
• 3.3 影响外植体分化率的因素
• 3.3.1 苗龄对甘蓝型油菜子叶柄和下胚轴分化的影响
• 3.3.2 不同激素配比对外植体再生率的影响
• 3.3.3 不同基因型子叶和下胚轴的分化再生能力比较
• 3.4 重组质粒pCAMBIA3301-ipt转化根癌农杆菌LBA4404的PCR验证
• 3.5 影响转化率的因素
• 3.5.1 不同的预培养时间对油菜子叶和下胚轴转化率的影响
• 3.5.2 共培养时间对遗传转化的影响
• 3.5.3 延迟培养时间对子叶和下胚轴遗传转化的影响
• 3.5.4 不同抗生素对抗性芽生根移栽生活率的影响
• 3.5.5 转基因植株获得及移栽
• 3.6 转化植株的Gus组织化学检测
• 3.7 转化植株的PCR检测
• 4 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 外植体的选择及其预培养
• 4.1.2 农杆菌浸染及外植体的共培养
• 3的作用'>4.1.3 农杆菌介导遗传转化过程中，培养基中外加AgNO₃的作用
• 4.1.4 延迟培养时间
• 4.1.5 抗生素的选择
• 4.2 结论
• 参考文献
• 附录一 主要英文缩写词表
• 附录二 植物表达载体pCAMBIA3301质粒图谱
• 致谢
• 个人简历
• 在校期间发表论文