T辅助细胞亚群联合检测对系统性红斑狼疮病情评估价值的研究

论文摘要

研究背景系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种自身免疫介导的,以免疫性炎症为主要表现的弥漫性结缔组织病。临床主要特征是多个器官、系统受累和血清检测到多种自身抗体（以抗核抗体为代表）。SLE病程迁延,病死率高,病因至今未明,也无特异有效的治疗方法。SLE发病过程中同时存在细胞免疫和体液免疫系统紊乱两种形式,而T淋巴细胞的异常并导致B淋巴细胞的过度活化,最终导致免疫系统的异常应答是其主要发病机制。近年来国内外对SLE的免疫紊乱研究趋于深入,多项研究认为由于SLE患者自身淋巴细胞平衡被打破,过度活化的T淋巴细胞导致多克隆B细胞分化和激活,从而产生大量自身抗体引起多系统损害受累。目前认为的T淋巴细胞的异常可能是SLE发病的重要因素。有研究表明SLE患者Th的凋亡显著增加,且凋亡水平与疾病活动性相关,因此,T辅助淋巴细胞（Th）的数量及功能失衡是T淋巴细胞免疫功能异常的重要方面。Th淋巴细胞不是单一的一种细胞群,而是包含了一系列具有不同职能的细胞亚群,幼稚CD4+T淋巴细胞可以分化为Th1、Th2、Th17和调节性T细胞（Treg）,四种细胞分泌的细胞因子以及在体内免疫作用各不相同。因此,这些不同职能的细胞亚群在分化、发育及功能执行等方面存在着错综复杂的关系,需要对Th细胞亚型在系统性红斑狼疮病因机制方面发挥的作用进行深入细致的研究,才能有助于进一步明确Th细胞在SLE的作用。早期,人们仅仅关注于Th1/Th2的失衡状态与SLE的发病关系。认为Th1/Th2的平衡状态在系统性红斑狼疮中起着决定性的作用,其间,“Th2优势”、“Th1优势”等多种免疫紊乱状态均在狼疮动物模型及患者体内被证实。但随着对SLE研究的深入,发现很多SLE临床征象和实验室特点不能用已知的Th1/Th2失衡模式来解释。近年来对T辅助细胞亚群的认识更加全面,在原有Th1/Th2细胞亚群基础上,Sakaguchi和Harrington先后在1995年和2005年又发现了调节性T细胞（Treg）和Th17两个新成员。逐渐发现Th17/Treg的平衡状态在SLE的疾病过程中发挥着重要作用。两者同属于Th细胞,但分化相互抑制,生物学表现完全相反。Th17启动自身免疫疾病发生, Treg细胞可减轻自身免疫病反应,两者相互拮抗相互抑制维持机体免疫状态的相对稳定。Th1、Th2、Th17、Treg细胞均参与了SLE的致病过程,并且Th1/Th2、Th17/Treg的失衡状态可能导致SLE患者细胞功能紊乱,进而引起B细胞异常活化,促发和加剧SLE病情变化。研究显示,Th17/Treg细胞亚群失衡状态在系统性红斑狼疮患者中可能更为严重,从而在某种程度上,两组细胞平衡状态可以作为SLE疾病活动和病情评价的可靠指标。故将Th1/Th2、Th17/Treg作为一个观察整体,可能比单纯研究某类细胞的变化来推断SLE疾病状态更加科学系统。总之,本研究从Th细胞的凋亡情况入手,深入分析Th1/Th2,Th17/Treg在SLE中的失衡状态,并相对全面系统分析Th1/Th2,Th17/Treg相关细胞因子谱变化特点,并对新成员Th17/Treg的特异转录因子的平衡状态进一步探究,以期通过相对较大样本的SLE病例资料,联合测定Th细胞亚群细胞、蛋白、基因水平变化及相应的SLE的疾病活动指标,探讨Th细胞亚群与SLE疾病活动性临床症状的关系及其对病情评估的价值。目的（1）通过比较系统性红斑狼疮患者和正常对照之间,SLE轻型、中度活动及重型患者之间的Th细胞凋亡情况,分析SLE患者Th细胞的凋亡与SLE疾病活动指数的关联。（2）通过比较系统性红斑狼疮患者和正常对照之间,SLE轻型、中度活动及重型患者之间的Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡情况,分析Th1/Th2、Th17/Treg细胞与SLE的关系。（3）系统分析SLE患者和正常对照之间,SLE轻型、中度活动及重型患者之间的Th1、Th2、Th17、Treg细胞因子水平,进一步验证Th1/Th2、Th17/Treg细胞与SLE的关系。（4）初步研究SLE患者和正常对照之间,SLE轻型、中度活动及重型患者之间的Th17/Treg分化路径上游特异的转录因子RORγt和Foxp3水平,进一步验证Th1/Th2、Th17/Treg细胞与SLE的关系。深入了解Th17和调节性T细胞在SLE发病及病情进展过程中的意义。方法病例选取2009年6月至2010年9月在山西医科大学第二医院和中国人民解放军第264医院风湿科就诊SLE患者89例,诊断均符合1997年修订的美国风湿学会（American College of Rheumatology,ACR）分类标准。收集SLE患者一般情况和临床资料,根据SLE疾病活动指数（systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI）积分评估疾病的活动性,并结合临床症状将患者分为轻型SLE、中度活动型、重型三组。同时选取正常对照组27名,均不符合SLE诊断标准;无其他重大疾病史;未长期应用激素或免疫抑制剂;受检者本人或直系的亲属未患有自身免疫性疾病。实验在获得研究对象知情同意后,抽取外周静脉血。采用流式细胞术检测SLE患者和正常对照之间,SLE轻型、中度活动及重型患者之间Th细胞凋亡率和Th1/Th2、Th17/Treg细胞水平。采用流式细胞微球捕获技术（CBA）和ELSIA测定SLE患者和正常对照之间,SLE轻型、中度活动及重型患者之间IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ,IL-17A和TGF-β水平采用RT-PCR检测SLE患者和正常对照之间,SLE轻型、中度活动及重型患者之间血清Th17/Treg特异转录因子RORγt和Foxp3 mRNA表达水平采用SPSS 13.0软件进行统计分析。结果（1）流式细胞术来测定Th细胞的凋亡情况显示SLE患者和正常人CD4+T淋巴细胞凋亡率分别为（1.11 0.36）%和（0.36 0.15）%,两者比较差异有统计学意义（P<0.0001）。轻型、中型、重型SLE患者组和正常对照组Th细胞凋亡率分别为（0.81 0.19）%、（1.030.21）%、（1.51 0.31）%和（0.36 0.15）%,组间比较差异有统计学意义（P<0.0001）（2）流式细胞术测定四种Th细胞情况:SLE患者组Th1显著低于正常组,差异有统计学意义（P =0.049）。SLE患者组Th2与正常组比较差异无统计学意义。重型SLE患者Th1/Th2与中度活动组及轻型组比较差异有统计学意义。相关性分析显示:Th2/CD4+与SLEDAI呈正相关（r=0.4012, P =0.0001）,Th1/Th2与SLEDAI呈负相关（r=-0.2683,P =0.0130）。SLE患者组Th17与正常组比较差异无统计学意义,但Th17占CD4+T细胞两组比较差异有统计学意义（P =0.012）,患者组比例较正常人高。SLE患者组Treg低于正常组,差异有统计学意义（ P=0.023）。重型SLE患者Th17、Th17/CD4+、Treg与正常对照组及轻型组比较差异有统计学意义。相关性分析显示:SLEDAI与Th17、Th17/CD4+和Th17/Treg呈正相关（r =0.3608, P =0.0006, r=0.4522, P <0.001,r=0.4240, P <0.001）,与Treg呈负相关（r=-0.352, P =0.0010）。（3）相关细胞因子测定结果:流式细胞微球捕获技术（CBA）测定SLE患者组与正常对照组IL-17、IL-10、IL-6、IL-4比较显著增高（P均<0.05）其余细胞因子比较差异无统计学意义。相关性分析显示:IL-17、IL-6、IL-4与SLEDAI呈正相关,IL-2、IFN-γ与SLEDAI呈负相关,尚不能认为TNF、IL-10与SLEDAI有相关性。IL-17在不同活动度组间比较差异均有统计学意义,且在SLE重型患者中增高最为明显（F=52.660,P <0.001）。IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-4、IL-2在不同活动度组间比较差异均有统计学意义（P <0.05）。TNF-α水平在不同活动度组间比较差异无统计学意义。ELISA测定TGF-β结果显示SLE患者和正常对照之间,SLE轻型、中度活动及重型患者之间比较差异无统计学意义（F=2.150,P =0.157）。相关性分析显示:尚不能认为TGF-β水平与SLEDAI有相关性（r=-0.071,P =0.5150）。（4）RT-PCR实验结果显示SLE患者Th17、Treg细胞的特异性转录因子ROR-γt、Foxp3的mRNA经RT-PCR扩增后均有所表达。SLE组ROR-γt、Foxp3的mRNA表达变化倍率显著高于正常对照组,比较差异均有统计学意义（t=-2.656,P =0.012;t=-2.873,P =0.007）。不同活动度SLE患者组间ROR-γt mRNA表达组间比较差异有统计学意义（F=3.335,P =0.047）,Foxp3 mRNA组间比较差异无统计学意义（F=2.119,P =0.129）。相关性分析显示:ROR-γt与SLEDAI、Th17呈正相关（r=0.4969, P =0.0038, r=0.3960, P =0.0992）,尚不能认为与其他相关Th细胞及细胞因子有相关性,同时尚不能认为Foxp3与SLEDAI及相关Th细胞及细胞因子有相关性。结论SLE患者存在Th细胞凋亡异常情况,且Th细胞凋亡率与SLEDAI评分有显著相关性。Th2/CD4+、Th17、Th17/CD4+、Th17/Treg与SLEDAI呈正相关,Th1/Th2、Treg与SLEDAI呈负相关。细胞因子检测IL-17、IL-6、IL-4与SLEDAI呈正相关,IL-2、IFN-γ与SLEDAI呈负相关,Th17细胞特异转录因子ROR-γt mRNA检测结果与SLEDAI、Th17呈正相关。研究表明SLE患者存在Th1/Th2、Th17/Treg失衡状态,且与疾病活动有关,联合检测Th细胞亚群,可能对于SLE病情评价更有意义。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略表
• 前言
• 第一部分T 辅助细胞凋亡在系统性红斑狼疮中的意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分T 辅助细胞在系统性红斑狼疮的失衡状态及与病情相关分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分T 辅助细胞相关细胞因子在系统性红斑狼疮中的变化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第四部分Th17、Treg 细胞转录因子在系统性红斑狼疮中的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一
• 参考文献
• 综述二
• 参考文献
• 附录1 ACR1997 年修订的SLE 分类标准
• 附录2 系统性红斑狼疮疾病活动指数（SLEDAI）.
• 个人简介
• 致谢