突触蛋白-Ⅰ在胚胎干细胞的神经分化和移植治疗脑缺血中的作用

论文摘要

研究背景和目的近年来，再生医学给脑缺血带来了新的希望。胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）由于具有很强的增殖和分化能力、可被大量地诱导成为神经细胞而成为再生医学移植供体的理想来源。由于ESC直接移植体内具有形成畸胎瘤的危险，因此应用ESC治疗脑缺血一般先在体外诱导分化出神经前体细胞或神经细胞，然后再移植进脑内。也就是说ESC治疗脑缺血的过程分为两部分，一是体外诱导ESC向神经细胞的分化，一是移植进脑内的ESC的迁移、增殖以及与宿主脑组织的整合。细胞分化是细胞特异基因在时间和空间上序贯性表达的结果，即哪些基因被激活和在什么时间与位点被激活，因此ESC向神经细胞的分化有着极其复杂的调控机制。同样地，ESC在宿主脑内的迁移、增殖和整合也受着自身机制和宿主机制的双重调控。因此寻求这一过程的可调控点或调控切入点是更好地应用ESC治疗脑缺血的关键环节。突触蛋白-Ⅰ（synapsin-Ⅰ）是一个有代表性的与突触囊泡相关的磷酸蛋白，在神经的早期发育分化和神经递质释放的过程中起着重要的作用。我们既往的研究也发现synapsin-Ⅰ在脑缺血再灌流后存在表达的变化。既然synapsin-Ⅰ与神经分化和脑缺血均密切相关，我们把synapsin-Ⅰ作为诱导ESC分化为神经细胞移植治疗脑缺血这一过程的可调控点或调控切入点的候选基因。通过研究synapsin-Ⅰ在ESC的神经分化及其移植治疗脑缺血这一过程的作用，验证synapsin-Ⅰ可否成为这一过程的可调控点或调控切入点，为进一步研究这一过程的调控机制提供依据。方法1．采用五步法和维甲酸法两种不同的途径体外诱导ESC向神经细胞分化，并以另一种可向神经细胞分化的肿瘤细胞——PC12细胞的诱导过程作参照，从不同的途径、不同的细胞进行比较，通过免疫组织化学、RT-PCR、western-blot方法观察这一过程synapsin-Ⅰ的表达变化，找出synapsin-Ⅰ在诱导细胞向神经细胞分化过程中表达变化的共同规律。2．于不同诱导阶段采用反义寡核苷酸技术抑制ESC和PC12细胞的synapsin-Ⅰ表达，比较抑制与不抑制的形态学、分化效率及其它神经特异性蛋白表达的变化，观察这种干预对细胞的神经分化过程的影响。3．建立大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型和PC12细胞缺氧+血清剥夺模型，通过免疫组织化学方法观察短暂脑缺血／缺氧+血清剥夺，再灌流／复给氧+血清后突触蛋白-Ⅰ的表达变化规律。4．采用transwell小室共培养ESC和遭受缺血缺氧打击的已分化的PC12细胞，模拟ESC移植迁移的过程，建立ESC移植治疗脑缺血的离体模型。采用Hoechst染色法和流式细胞仪计算ESC的迁移率，比较分化与未分化ESC的迁移能力、受缺血缺氧打击与未受缺血缺氧打击PC12细胞对ESC的吸引力；然后采用反义寡核苷酸技术抑制ESC的synapsin-Ⅰ表达，观察抑制后ESC迁移能力和形态学的改变。结果1．结合形态学和其它神经特异性指标的变化，synapsin-Ⅰ在ESC和PC12细胞向神经细胞分化的过程中具有早期即有表达，后逐渐升高，至分化成熟阶段达最高，后期又逐渐下降的变化规律。2．于不同诱导分化阶段抑制synapsin-Ⅰ的表达均可导致ESC向神经细胞分化的进程较正常滞后和神经分化效率的降低，以早期分化阶段明显。第三、四阶段抑制synapsin-Ⅰ的表达导致第三、四阶段末神经前体细胞（nestin阳性细胞）比例较正常分化明显减少（第三阶段末：76.2±5.1％VS 68.5±4.2％，P＜0.05，第四阶段末：90.2±4.3％VS 75.1±4.7％，P＜0.01），细胞的突起伸长速度减慢。第五阶段抑制synapsin-Ⅰ的表达导致第五阶段末神经元样细胞、MAP2阳性细胞的比例减少（41.2±2.7％VS 30.7±3.2％，P＜0.05），细胞之间的联系减少。抑制PC12细胞synapsin-Ⅰ的表达后也出现整个分化过程滞后的情况，大部分细胞突起较正常诱导分化过程短，诱导1d、4d、7d、10d分化细胞的百分率由正常分化过程的1.81±0.40％、45.13±4.17％、90.26±4.68％、84.66±4.81％降至0.33±0.46％、9.78±3.47％、45.3±7.98％、34.2±5.89％，转染组与正常分化组比较差异有显著性意义（P＜0.01）。3．MCAO模型和PC12细胞缺氧模型均显示短暂脑缺血／缺氧，再灌流／复给氧12h内synapsinⅠ的表达无明显变化，再灌流／复给氧后24 h降低（P＜0.01），至72 h恢复至对照组水平。4．遭受缺氧缺血打击后的PC12细胞比未遭受缺氧缺血打击的PC12细胞更能吸引ESC的迁移，迁移向缺血PC12细胞的ESC比迁移向未缺血的PC12细胞增多68％以上甚至数倍。抑制synapsin-ⅠmRNA的表达后，ESC的迁移细胞数较未转染前明显减少（P＜0.05）。PC12细胞遭受缺血打击后24h移植的未分化和已分化ESC迁移数明显高于立即移植的ESC迁移数，两者的比值分别为1.97和2.04。结论1．synapsin-Ⅰ在ESC的体外神经分化过程中起着重要的作用，而且在分化的不同阶段所起的作用不同，在分化的早期可能起着更为重要的作用。2．在ESC移植治疗脑缺血的离体研究中、ESC的迁移数受宿主细胞内环境的影响，并可能与ESC自身和宿主细胞的synapsin-Ⅰ的表达水平有关。3．synapsin-Ⅰ可能参与了ESC向神经细胞分化及移植治疗脑缺血过程的调控机制，有望成为这一过程的理想调控点或调控切入点。4．transwell共培养体系可能成为体外建立干细胞迁移、分化模型的实用新型的工具。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、正文
• 前言
• 第一部分 不同方法体外诱导胚胎干细胞向神经细胞分化的比较
• 第二部分 突触蛋白-Ⅰ在胚胎干细胞的体外神经分化过程中的作用
• 第三部分 短暂缺血缺氧后突触蛋白-Ⅰ的表达及其磷酸化水平
• 第四部分 突触蛋白-Ⅰ在胚胎干细胞移植治疗脑缺血的离体模型中的作用
• 全文小结
• 四、综述
• 综述一 突触蛋白的结构与功能
• 综述二 突触蛋白与神经系统疾病
• 五、附录（发表论文）
• 六、致谢