灵芝硒多糖SeGLP-2B-1诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡机制的研究

论文摘要

硒多糖作为一种有机硒化合物,兼有多糖与硒的活性,其生物活性普遍高于多糖和硒,更易于为机体吸收和利用。本实验通过生物转化的方法把无机硒加入到灵芝菌丝体中,将灵芝多糖和硒有机结合成为灵芝硒多糖,使硒和多糖的生理及药理功能得到优化。灵芝硒多糖具有多种生理活性,它可拮抗重金属中毒和抗活性氧损伤,从而发挥其抗氧化作用;影响细胞周期,使肿瘤细胞DNA合成受阻而抑制肿瘤细胞生长;并能够通过氧化应激、ROS介导、调控癌基因和抑癌基因的表达、调节细胞周期相关蛋白、激活caspase系列酶等途径诱导肿瘤细胞凋亡等。本实验通过灵芝深层发酵,有效的将无机硒转化成有机硒并富集于灵芝菌丝体中,并从中分离纯化得到灵芝硒多糖SeGLP-2B-1。SeGLP-2B-1可以诱导肿瘤细胞MCF-7凋亡。将其作用于MCF-7细胞24h、48h、72h后,用MTT法检测抑制率,结果显示SeGLP-2B-1作用MCF-7 24h后,细胞开始出现凋亡,凋亡率达到25.39%。延长作用至72小时,最高的抑制率可达到80.53%,IC50值达0.158μM;利用琼脂糖凝胶电泳观察DNA的变化发现,药物作用24h后,MCF-7细胞DNA电泳开始有少量降解,72h后可明显看到DNA被降解的现象;用PI染色法通过流式细胞仪检测SeGLP-2B-1对MCF-7细胞周期的影响,SeGLP-2B-1作用24h后可看见明显的AP峰,说明MCF-7细胞已经开始凋亡。以上实验结果说明SeGLP-2B-1对MCF-7细胞有明显的抑制作用,可以诱导MCF-7细胞出现凋亡。本实验初步探讨了SeGLP-2B-1诱导肿瘤细胞MCF-7凋亡的分子机制。运用Rhodamine123荧光染色,通过流式细胞仪检测细胞内线粒体的膜电位,SeGLP-2B-1作用24h后MCF-7细胞线粒体膜电位开始下降,延长至72h后线粒体膜电位下降一倍以上,证明此时MCF-7细胞线粒体膜的完整性已经被破坏,线粒体跨膜位点（ΔΨm）崩溃。而细胞质中细胞色素C含量的增加,又进一步证明了线粒体膜通透性转运孔开放,导致线粒体中细胞色素C释放到细胞质中。细胞色素C能诱导细胞凋亡信号中caspase系列蛋白的激活,即级联瀑布效应。本研究通过western blot证明SeGLP-2B-1作用MCF-7细胞48h后,caspase-9和caspase-3已被激活,PARP发生裂解,产生83kD的分子。caspase-9是线粒体途径的关键酶,可以激活凋亡效应信号蛋白caspase-3,从而引发凋亡的发生。本研究发现SeGLP-2B-1作用48h后,caspase-8也可以被激活。caspase-8是细胞凋亡中死亡受体途径的信号蛋白,说明SeGLP-2B-1可能同时通过两条途径诱导MCF-7细胞凋亡。0.09μMSeGLP-2B-1作用细胞24h、48h、72h后,细胞内ROS的水平降低,降低量呈时效关系。说明低浓度的灵芝硒多糖SeGLP-2B-1可以通过提高谷胱甘肽过氧化物酶GPx的活性,降低肿瘤细胞内活性氧水平来提高细胞内的抗氧化性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 硒化合物的抗肿瘤研究
• 1.1.1 硒化合物的种类
• 1.1.2 硒化合物的抗肿瘤作用
• 1.1.3 硒化合物生物活性与抗肿瘤作用的关系
• 1.1.3.1 硒化合物的细胞毒作用
• 1.1.3.2 硒化合物的抗氧化作用
• 1.1.3.3 硒化合物的解毒作用
• 1.1.3.4 硒化合物的免疫作用
• 1.1.3.5 硒化合物诱导肿瘤细胞凋亡
• 1.1.3.6 硒化合物对癌基因的影响
• 1.1.3.7 硒化合物与其他元素、维生素相互作用
• 1.1.3.8 硒化合物的其它抗肿瘤作用
• 1.2 多糖诱导肿瘤细胞凋亡的研究
• 1.2.1 细胞凋亡及其机制
• 1.2.1.1 细胞凋亡
• 1.2.1.2 细胞凋亡的分子机制
• 1.2.2 多糖能诱导肿瘤细胞凋亡
• 1.2.3 多糖诱导肿瘤细胞凋亡的机制
• 1.2.3.1 调控癌基因
• 1.2.3.2 死亡受体途径
• 1.2.3.3 线粒体途径
• 1.2.3.4 端粒酶
• 1.2.3.5 DNA 拓扑酶
• 1.2.3.6 改变钙离子浓度
• 1.2.3.7 改变膜流动性
• 1.3 硒多糖的生物学特性及诱导肿瘤细胞凋亡的研究
• 1.3.1 硒多糖的来源及其分离纯化
• 1.3.2 硒多糖的结构特性及检测手段
• 1.3.3 硒多糖能诱导肿瘤细胞凋亡
• 1.3.4 硒多糖诱导肿瘤细胞凋亡的机制
• 1.3.4.1 氧化应激与细胞凋亡
• 1.3.4.2 基因调控与细胞凋亡
• 1.3.4.3 细胞周期与细胞凋亡
• 1.3.4.4 死亡受体与细胞凋亡
• 1.3.4.5 线粒体与细胞凋亡
• 1.3.4.6 其他凋亡机制
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 富硒灵芝的培养及其分离纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 材料和试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 富硒灵芝的培养
• 2.2.2 灵芝硒多糖的提取
• 2.2.3 灵芝硒多糖的分离纯化
• 2.2.3.1 去蛋白
• 2.2.3.2 脱色
• 2.2.3.3 分级沉淀
• 2.2.3.4 DEAE 纤维素柱层析
• 2.2.3.5 高效液相色谱HPLC 纯化
• 2.2.3.6 灵芝硒多糖SeGLP-2B-1 的HPLC 纯化
• 2.2.4 各级灵芝硒多糖中硒含量的测定
• 2.3 结果和分析
• 2.3.1 DEAE-Cellulose 纤维柱层析分离纯化灵芝硒多糖SeGLP-2B
• 2.3.2 TSK-G5000PW 柱的HPLC 分离纯化灵芝硒多糖SeGLP-2B
• 2.3.3 硒多糖SeGLP-2B-1 SHIM-PACK 柱的HPLC 纯化
• 2.4 讨论
• 第三章 灵芝硒多糖 SeGLP-2B-1 诱导 MCF-7 细胞凋亡的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 材料和试剂
• 3.1.2 动物瘤株
• 3.1.3 仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 细胞培养
• 3.2.2 实验药物的选择
• 3.2.3 体外药物敏感性和细胞生长抑制实验-MTT 比色法
• 3.2.4 MCF-7 细胞总DNA 提取及琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.5 流式细胞仪测定细胞周期
• 3.3 结果
• 3.3.1 SeGLP-2B-1 对MCF-7 细胞的生长抑制作用
• 3.3.2 SeGLP-2B-1 对MCF-7 细胞DNA 的影响
• 3.3.3 SeGLP-2B-1 对细胞周期的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 灵芝硒多糖 SeGLP-2B-1 诱导 MCF-7 细胞凋亡机制的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化
• 4.2.1.1 Rhodamine123 的配制
• 4.2.1.2 处理收集细胞
• 4.2.1.3 Rhodamine123 反应
• 4.2.2 ROS 检测试剂盒检测细胞内活性氧水平
• 4.2.2.1 DCFH-DA 的配制
• 4.2.2.2 处理收集细胞
• 4.2.2.3 加DCFH-DA 作用并检测
• 4.2.3 Western Blot 检测caspase 系列酶的表达
• 4.2.3.1 处理收集细胞
• 4.2.3.2 蛋白提取
• 4.2.3.3 测定样品蛋白质浓度
• 4.2.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.2.3.5 转膜
• 4.2.3.6 封闭
• 4.2.3.7 一抗结合
• 4.2.3.8 二抗结合
• 4.2.3.9 ECL 显色
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 SeGLP-2B-1 对细胞线粒体膜电位的影响
• 4.3.2 SeGLP-2B-1 对细胞内活性氧水平的影响
• 4.3.3 SeGLP-2B-1 对MCF-7 细胞内细胞色素C 表达水平的影响
• 4.3.4 SeGLP-2B-1 对MCF-7 细胞内caspase 系列酶表达水平的影响
• 4.3.5 SeGLP-2B-1 对MCF-7 细胞内PARP 表达水平的影响
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历及硕士在读期间科研成果和发表论文的情况