抗三唑磷基因工程抗体的研制及同源建模

论文摘要

为了研制基因工程抗体,本文首先通过杂交瘤技术筛选能够稳定分泌高亲和力、高特异性抗体的杂交瘤细胞,以从中克隆编码抗体可变区的基因。利用杂交瘤细胞制备的单克隆抗体建立了三唑磷残留ELISA检测方法,并对方法进行了系统优化。优化后的ELISA应用于食品和环境样品中三唑磷残留检测,其良好的回收率和较小的变异系数一方面证明了ELISA在三唑磷等农药的残留检测中具有良好的应用前景,另一方面也说明筛选的杂交瘤细胞是成功的,可以用于基因工程抗体的研制。然后从杂交瘤细胞株出发,通过RT-PCR技术,利用小鼠重链和轻链可变区通用引物扩增得到了抗三唑磷单克隆抗体轻、重链可变区基因序列。再通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）方法,将两个可变区基因连接起来,构建了单链抗体（ScFv）核苷酸序列。然后将ScFv序列插入到pET-29a（+）载体,得到了重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,阳性菌株经IPTG诱导培养后,表达得到了ScFv蛋白。蛋白经过变性、纯化和复性处理后,通过竟争抑制ELISA进行了初步鉴定,结果表明,ScFv具有免疫亲和活性。在此基础上,利用Accelrys公司的Discovery StudioTM（DS）软件系统通过同源建模法模拟了抗三唑磷单链抗体的三级结构及ScFv与三唑磷农药小分子间的对接构象。首先通过模板分子搜索、序列比对、构建模型及模型合理性评价等过程分别构建了轻、重链可变区三维结构;然后再通过模板分子搜索、序列比对及叠合等过程,初步构建了ScFv的三维结构模型。模型经过动力学和能量最小化优化后,最终得到了评价合理的ScFv的三维结构。分子对接模拟结果显示,单链抗体与三唑磷主要以范德华力和氢键发生相互作用,抗体有13个氨基酸残基可以与农药分子发生作用。这些氨基酸作用位点和作用方式的确定为进一步进行抗体分子的改造和研究抗体与农药小分子间的作用机理打下了坚实的基础。最后在二硫键稳定抗体（dsFv）的研制、dsFv同源建模及分子对接方面开展了部分工作。利用PCR定点突变法,通过设计突变引物,成功地将半胱氨酸突变位点引入了轻、重链可变区的相应位点,从而为dsFv小分子抗体的研制打下了基础。DS软件系统对dsFv三级结构及dsFv与三唑磷的对接构象的模拟结果表明,dsFv与ScFv具有相似的活性口袋,在与三唑磷发生对接过程中,也是以氢键和范德华力作为主要作用方式,参与作用的氨基酸残基大部分相同,但dsFv可参与反应的氨基酸数目更多,这意味着dsFv和ScFv对三唑磷的亲和力可能会有差异。

论文目录

• 目录
• 致谢
• 术语和缩略语表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 免疫分析技术在农药残留检测中的应用
• 2 基因工程抗体
• 2.1 基因工程抗体的分类
• 2.1.1 人源化抗体
• 2.1.2 小分子抗体
• 2.1.3 双（多）价抗体
• 2.1.4 双特异抗体
• 2.1.5 抗体融合蛋白
• 2.1.6 抗体库技术
• 2.2 基因工程抗体的表达
• 2.2.1 哺乳动物细胞表达系统
• 2.2.2 大肠杆菌表达系统
• 2.2.3 酵母和昆虫细胞表达体系
• 2.2.4 动植物表达系统
• 2.3 包涵体的分离、变性及复性
• 2.3.1 包涵体的分离及变性
• 2.3.2 包涵体的复性
• 2.4 基因工程抗体在农药残留检测方面的研究进展
• 3 分子间相互作用
• 3.1 蛋白质结构预测方法
• 3.1.1 同源建模法
• 3.1.2 折叠识别法
• 3.1.3 从头预测法
• 3.2 分子对接
• 3.2.1 分子对接的基本步骤
• 3.2.2 分子对接方法的分类
• 3.2.3 分子对接的模拟方法
• 3.3 计算机模拟在抗体与农药小分子相互作用方面的应用
• 4 研究目的和意义
• 第二章 抗三唑磷基因工程抗体亲本杂交瘤细胞株的筛选
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂与药品
• 2.1.2 缓冲液
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 实验动物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 半抗原的合成和免疫抗原、包被抗原、酶标半抗原的制备
• 2.2.2 抗三唑磷单克隆抗体的制备
• 2.2.3 直接竞争ELISA方法的建立
• 2.2.3.1 抗原—抗体工作浓度选择
• 2.2.3.2 抗体亲和力和检测灵敏度
• 2.2.4 ELISA方法优化
• 2.2.4.1 不同盐离子浓度对ELISA反应的影响
• 2.2.4.2 pH对ELISA反应的影响
• 2.2.4.3 添加剂对ELISA反应的影响
• 2.2.4.4 有机溶剂对ELISA反应的影响
• 2.2.4.5 底物的选择
• 2.2.5 ELISA方法验证
• 2.2.5.1 方法的特异性
• 2.2.5.2 方法的准确性试验
• 2.2.5.3 样品前处理方法
• 3 结果与分析
• 3.1 三唑磷半抗原
• 3.2 抗体效价测定
• 3.3 ELISA方法建立
• 3.4 ELISA方法优化
• 3.4.1 离子浓度对抗原抗体结合反应的影响
• 3.4.2 pH值的影响
• 3.4.3 添加剂的影响
• 3.4.4 有机溶剂的影响
• 3.4.5 底物
• 3.5 ELISA方法验证
• 3.5.1 抗体的特异性
• 3.5.2 方法的准确性试验
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第三章 抗三唑磷ScFv基因构建及其在大肠杆菌的表达和初步鉴定
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂与药品
• 2.1.2 缓冲液
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 细胞株和宿主菌
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.1.1 抗体可变区引物设计
• 2.2.1.2 ScFv基因构建引物
• 2.2.1.3 内参引物
• 2.2.2 总RNA的提取
• 2.2.3 RNA的变性琼脂糖凝胶检测
• 2.2.4 cDNA第一链的合成
• 2.2.5 cDNA检测
• 2.2.6 抗体可变区基因扩增
• 2.2.7 可变区基因纯化、回收
• 2.2.8 超级感受态大肠杆菌的制备
• 2.2.9 可变区基因克隆
• 2.2.9.1 T载体连接
• 2.2.9.2 转化
• 2.2.9.3 阳性菌落的筛选、质粒提取
• H/V_L质粒鉴定'>2.2.10 重组V_H/V_L质粒鉴定
• 2.2.10.1 PCR鉴定
• 2.2.10.2 测序鉴定
• 2.2.10.3 DNA序列计算机分析
• 2.2.11 抗三唑磷ScFv基因的构建
• 2.2.12 ScFv基因的回收、克隆及重组质粒的鉴定
• 2.2.13 抗三唑磷ScFv重组表达质粒（pET-Tap-ScFv）的构建
• 2.2.14 表达质粒转化
• 2.2.15 阳性菌落的筛选
• 2.2.16 抗三唑磷ScFv基因的诱导表达
• 2.2.17 表达抗体的变性与复性
• 2.2.18 抗三唑磷ScFv活性鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA的提取
• 3.2 β-肌动蛋白基因序列扩增
• 3.3 可变区基因的扩增
• 3.4 可变区基因的克隆与鉴定
• H和V_L序列分析'>3.5 V_H和V_L序列分析
• 3.6 ScFv基因的构建
• 3.7 ScFv基因的克隆和鉴定
• 3.8 ScFv重组表达质粒的构建、转化及阳性转化菌的筛选
• 3.9 抗三唑磷ScFv在大肠杆菌的表达
• 3.10 表达蛋白变性、纯化与复性
• 3.11 抗三唑磷ScFv免疫活性鉴定
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第四章 抗三唑磷单链抗体（ScFv）三级结构同源建模
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 氨基酸序列
• 2.1.2 软件及模块
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• H链空间结构建模'>3.1 V_H链空间结构建模
• 3.1.1 同源蛋白序列搜索
• 3.1.2 序列比对
• 3.1.3 同源建模
• 3.1.4 模型评价
• L链空间结构建模'>3.2 V_L链空间结构建模
• 3.2.1 同源蛋白序列搜索
• 3.2.2 序列比对
• 3.2.3 同源建模
• 3.2.4 模型评价
• 3.3 抗三唑磷ScFv空间结构建模
• 3.3.1 VH-VL模板分子搜索
• H和V_L链与模板分子叠合'>3.3.2 V_H和V_L链与模板分子叠合
• 4S）₃'>3.3.3 加连接肽（G₄S）₃
• 3.3.4 抗三唑磷ScFv三维模型评价
• 3.3.5 抗三唑磷三维模型动力学优化
• 3.4 抗三唑磷ScFv与农药分子相互作用
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第五章 后续工作进展及全文总结
• 1 后续工作
• 1.1 抗三唑磷dsFv的研制
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.1.1 试剂与药品
• 1.1.1.2 缓冲液
• 1.1.1.3 仪器与设备
• 1.1.1.4 宿主菌
• 1.1.1.5 软件
• 1.1.2 实验方法
• 1.1.2.1 氨基酸序列编码
• 1.1.2.2 引物设计
• 1.1.2.3 重链可变区基因扩展
• 1.1.2.4 轻链可变区基因扩展
• 1.1.2.5 可变区基因克隆与鉴定
• 1.2 抗三唑磷dsFv同源建模
• 1.2.1 材料与方法
• 1.2.1.1 氨基酸序列
• 1.2.1.2 软件
• 1.2.1.3 方法
• 1.2.2 结果与分析
• 1.2.2.1 抗三唑磷dsFv空间结构建模及评价
• 1.2.2.2 抗三唑磷dsFv与农药分子相互作用
• 1.3 小结与讨论
• 1.3.1 小结
• 1.3.2 讨论
• 2 全文总结
• 3 全文创新点
• 4 不足与展望
• 参考文献
• 作者简历