丝胶肽的制备及其生物活性功能和结构的研究

论文摘要

来源于蚕丝的丝胶作为一种新型的食品蛋白资源,不但具有食用价值而且具有药用价值,因此对丝胶进行功能性食品的开发利用,不仅提升了丝胶作为丝绸加工副产品的经济价值,而且具有较大的社会效益。本文以丝绸废水中的丝胶为原料,建立了丝胶的提取工艺和酶解工艺;探讨了DA201-C大孔吸附树脂对丝胶酶解产物的精制处理及其分离组分的生物活性;提取丝胶酶解产物中抗氧化性类黑精组分并分析其理化性质和结构特征;以D-半乳糖致衰老动物模型,探讨了丝胶肽抗衰老的效果。本文的研究为开发功能性食品配料――丝胶肽提供了理论基础。本文首先建立了低温乙醇沉淀法提取丝绸废水中丝胶的工艺流程,并使丝胶的提取率达到64%。理化性质研究结果表明醇提丝胶约含有90%以上蛋白质,1%糖和4%灰分;明显地去除了蚕腥恶臭味,但溶解性有所下降;氨基酸组成中含极性侧链的氨基酸达到70%,疏水性值为2.21 KJ.mol-1,表明醇提丝胶为亲水性蛋白质;醇提丝胶相对分子质量分布比较宽,且多数组分分布在10,000～500,000之间。本文进一步通过扫描电镜（SEM）、差式扫描量热法（DSC）、圆二色性（CD）和红外光谱（IR）的测定探讨了醇提工艺对丝胶蛋白质超微结构和分子构象稳定性的影响。SEM结果表明在低温乙醇溶液中蛋白质分子间产生交联聚集形成致密的球状聚集体结构,当脱乙醇并在水溶液中复溶后,这种聚集作用被减弱,分子展开形成三维的网状结构;DSC、CD和IR结果表明蛋白质分子已发生部分变性,而这种变性可能与β-转角构象的出现有关,即部分的分子链通过β-转角这种折叠的构象进行组装,使分子结构从无序的状态向有序的状态转化,从而导致醇提的丝胶蛋白质的溶解性有所下降。此外,GC-MS分析结果表明使丝胶产生蚕腥恶臭味的风味组分主要是杂环类和烃类的挥发性化合物,经过醇提工艺处理后丝胶的蚕腥恶臭味明显被去除,使丝胶适用于食品的开发和利用。本文通过比较五种微生物来源的蛋白酶对丝胶的水解能力,确定最适水解酶为AS1398中性蛋白酶;通过单因素试验和响应面分析确定丝胶最佳酶解条件为:pH 6.1,温度55°C,加酶量（[E]/[S]）2% （w/w %）,该条件下的水解度为23.35%。与醇提丝胶比较,丝胶酶解产物的蛋白质含量略有下降,灰分含量和糖的含量增加;丝胶酶解产物相对分子质量主要分布在200～1000之间,含2～5个氨基酸的短肽比例约占50%左右。本文采用DA201-C大孔吸附树脂对丝胶酶解产物进行精制,即进行初步分离纯化、脱盐和分离褐色组分的处理,结果表明丝胶酶解产物按疏水性的不同利用大孔吸附树脂用乙醇溶液梯度洗脱可分离为四个组分（DK-1,DK-2,DK-3, DK-4）;电导率和灰分含量的测定结果表明,利用大孔吸附树脂可以对丝胶蛋白酶解产物中被树脂吸附的组分进行有效地脱盐;通过420 nm特征吸光值的测定和色泽的分析,结果表明DA201-C大孔吸附树脂可以分离提取丝胶酶解产物中黑褐色物质,从而使非褐色的组分（DK-1）达到脱色的效果。经过大孔吸附树脂分离纯化得到含有黑褐色物质的DK-3组分,生物活性分析结果表明DK-3组分具有清除DPPH·的效果,抑制酪氨酸酶活性的作用和螯合Fe2+能力,其EC50分别为2.49 mg/mL,3.13 mg/mL和0.90 mg/mL;将经过纳滤脱盐处理的DK-1组分应用于冻藏鱼糜中,结果表明DK-1组分的添加显著地提高鱼糜肌动球蛋白质的总巯基含量、降低表面疏水性及减缓肌球蛋白质重链（MHC）和肌动蛋白（AC）的降解,说明DK-1组分具有防止鱼糜肌动球蛋白质冷冻变性的作用,而且与浓度存在一定的相关性,在实际应用时,其添加量不宜太高。本文通过SDS-PAGE结合PAS染色法鉴定出丝胶中含有高分子量的糖蛋白;通过β-消去反应判断丝胶中存在O-连接方式的糖肽键;通过GC-MS分析鉴定出嘧啶、2-（5-氯-2-甲氧基亚苄基）-吡咯和吡啶酮等美拉德反应产生的特征性杂环类化合物。以上结果证实丝胶在酶解工艺过程中发生了美拉德反应,从而为丝胶酶解产物中类黑精的产生提供一定的依据。本文将经过大孔吸附树脂分离纯化得到的DK-3组分通过聚酰胺柱层析和RP-HPLC进一步分离纯化,得到在220 nm、280 nm和420 nm均有明显吸收的类黑精组分（RP-M）。抗氧化活性测定结果表明RP-M类黑精组分具有清除DPPH·的效果,其EC50为0.13 mg/mL;可抑制H2O2的氧化损伤,具有明显的神经细胞保护作用,但添加量过高时对细胞反而有毒性作用;RP-M组分氨基酸组成中赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）和脯氨酸（Pro）及一些疏水性的氨基酸的含量都明显地增加,说明这些氨基酸是组成类黑精肽骨架结构的主要氨基酸;RP-M组分相对分子质量主要分布在1,000～50,000之间,其中大于7,500的成分含量约占50%,而且MALDI-TOF MS测定的质量指纹图谱表明相对分子质量小于1000的短肽为RP-M类黑精组分基本的肽骨架单元,这些结果说明RP-M组分是通过短肽的复合形成聚合度不等的高分子量混合体。ESI-MS-MS质谱分析结果表明RP-M组分含有m/z分别为529.8715、462.3399和398.3169的三个特征的肽段,其氨基酸序列结构分别为:IILLLAAKFG、KVIIKPLI和QPVIAHM。这些肽段的氨基酸序列结构上具备抗氧化肽的特征,说明RP-M类黑精组分的肽骨架结构可能与其抗氧化活性相关。此外,特征肽段氨基酸组成中都含有的Lys和Pro,是形成类黑精最具活性的两种氨基酸残基,对短肽的复合和色素分子的聚合可能起到交联的作用。红外光谱分析结果表明RP-M组分结构中含有芳族胺、芳族羧酸和烷烃结构。紫外-可见光谱分析结果表明,RP-M组分在200 nm380 nm范围内有强的吸收,在275 nm280 nm处有一个吸收峰。RP-M组分酸水解样品经RP-HPLC分离纯化得到一个在420 nm处有明显吸收的S-4色素组分。红外光谱、紫外光谱和核磁共振的分析结果表明S-4色素组分是一种α-型吡喃糖类物质,说明类黑精组分的色素可由糖基化的物质形成。本文通过动物试验研究了丝胶肽抗衰老的效果。结果表明丝胶肽可显著提高D-半乳糖致衰老模型老鼠血清中SOD活性和降低MDA含量;可显著增加脾脏的重量;可改善D-半乳糖致衰老模型老鼠学习记忆的能力;减缓D-半乳糖对海马神经细胞的损伤;提高脑组织中抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达水平。结果说明丝胶肽可通过提高体内抗氧化作用,增强机体免疫力功能和延缓脑组织的老化作用起到抗衰老的效果。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 丝胶的性质与结构

1.2 丝胶提取方法的研究进展

1.2.1 化学方法

1.2.1.1 酸析法

1.2.1.2 化学混凝法

1.2.1.3 有机溶剂沉淀法

1.2.2 物理方法

1.2.2.1 离心法

1.2.2.2 超滤浓缩法

1.3 丝胶的开发和利用

1.3.1 在食品中的应用

1.3.1.1 丝胶及其水解产物的营养价值和生物活性功能

1.3.1.2 丝胶及其水解产物食品开发现状及前景

1.3.2 在医药中的应用

1.3.3 在化妆品中的应用

1.3.4 在材料中的应用

1.4 酶法制备生物活性肽的研究进展

1.5 类黑精的研究进展

1.6 本课题立题背景和意义

1.7 本论文主要研究内容

参考文献

第二章丝绸废水中丝胶的提取及其理化性质

2.1 前言

2.2 实验材料与仪器

2.2.1 实验材料与主要试剂

2.2.2 主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 原料的预处理

2.3.2 酸析法提取丝胶

2.3.3 低温乙醇沉淀法提取丝胶

2.3.4 丝绸生产废水中丝胶的提取工艺

2.3.5 分析方法

2.3.5.1 基本成分分析

2.3.5.2 氮可溶解指数（NSI）测定

2.3.5.3 蚕腥味的分析

2.3.5.4 氨基酸组成分析

2.3.5.5 蛋白质或多肽疏水值的计算[7]

2.3.5.6 HPLC 测定相对分子质量分布（<10,000）

10,000）'>2.3.5.7 凝胶过滤色谱和SDS-PAGE 电泳测定相对分子质量分布（>10,000）

2.3.6 丝胶蛋白质的超微结构测定

2.3.7 丝胶蛋白质的热性质测定

2.3.8 圆二色性（CD）测定

2.3.9 红外光谱（IR）测定

2.3.10 气相色谱质谱联用分析丝胶中挥发性组分

2.3.10.1 挥发性组分的固相微萃取（SPME）

2.3.10.2 气相色谱质谱联用分析

2.4 结果与讨论

2.4.1 丝胶提取方法的比较

2.4.2 预处理的丝胶及醇提的丝胶理化性质

2.4.3 醇提丝胶蛋白质氨基酸组成和疏水性

2.4.4 醇提丝胶蛋白质相对分子质量分布

2.4.5 丝胶蛋白质的超微结构

2.4.6 丝胶蛋白质的热性质

2.4.7 丝胶蛋白质分子构象

2.4.7.1 圆二色性

2.4.7.2 红外光谱

2.4.8 丝胶中挥发性组分

2.5 本章小结

参考文献

第三章酶法水解丝胶蛋白的研究

3.1 前言

3.2 实验材料与设备

3.2.1 实验材料和主要试剂

3.2.2 仪器设备

3.3 实验方法

3.3.1 水解度（DH）测定

3.3.2 酶解工艺及酶解产物的分离

3.3.3 丝胶酶解工艺条件的优化

3.3.4 理化性质分析

3.3.4.1 基本成分分析

3.3.4.2 氨基酸组成测定

3.3.4.3 相对分子质量分布测定

3.4 结果与讨论

3.4.1 不同蛋白酶对丝胶蛋白水解能力的比较

3.4.2 AS1398 蛋白酶水解丝胶蛋白的影响因素

3.4.2.1 底物浓度对丝胶蛋白水解度的影响

3.4.2.2 pH 对丝胶蛋白水解度的影响

3.4.2.3 加酶量（[E]/[S]）对丝胶蛋白水解度的影响

3.4.3 AS1398 蛋白酶酶解条件的优化

3.4.3.1 回归分析

3.4.3.2 最优酶解条件的确定及其验证

3.4.4 丝胶蛋白酶解产物的组成分析

3.5 本章小结

参考文献

第四章丝胶酶解产物的精制及其生物活性的的研究

4.1 前言

4.2 实验材料与设备

4.2.1 实验材料和主要试剂

4.2.2 仪器设备

4.3 实验方法

4.3.1 DA201-C 大孔吸附树脂对丝胶酶解产物的分离

4.3.2 采用DA201-C 大孔吸附树脂对丝胶酶解产物进行脱盐

4.3.3 DA201-C 大孔吸附树脂对丝胶酶解产物脱色效果的分析

4.3.4 理化性质分析

4.3.4.1 基本成分分析

4.3.4.2 氨基酸组成测定

4.3.4.3 相对分子量分布测定

4.3.5 生物活性的分析

4.3.5.1 二苯基苦味肼基自由基（DPPH·）清除能力的测定

2+ 螯合力的测定'>4.3.5.2 Fe²⁺螯合力的测定

4.3.5.3 抑制酪氨酸酶活性的测定

4.3.5.4 对鱼糜肌动球蛋白质冷冻变性保护作用的分析

4.4 结果与讨论

4.4.1 丝胶酶解产物的初分离

4.4.2 丝胶酶解产物的脱盐

4.4.3 丝胶酶解产物的脱色

4.4.4 DK-3 组分生物活性分析

4.4.4.1 DK-3 组分清除DPPH·的效果

4.4.4.2 DK-3 组分对酪氨酸酶活性的抑制作用

4.4.4.3 DK-3 组分对Fe2+螯合能力

4.4.5 DK-1 组分对鱼糜肌动球蛋白质冷冻变性保护作用

4.4.5.1 DK-1 组分对肌动球蛋白总巯基含量变化的影响

4.4.5.2 DK-1 组分对肌动球蛋白表面疏水性变化的影响

4.4.5.3 DK-1 组分对肌动球蛋白降解的影响

4.5 本章小结

参考文献

第五章丝胶酶解产物中抗氧化性类黑精的研究

5.1 前言

5.2 实验材料与设备

5.2.1 实验材料和主要试剂

5.2.2 仪器设备

5.3 实验方法

5.3.1 SDS-PAGE 结合过碘酸--希夫（PAS）染色鉴定糖蛋白

5.3.2 O-糖肽键的测定――β-消去反应

5.3.3 气相色谱质谱联用测定丝胶酶解产物中挥发性杂环化合物

5.3.4 聚酰胺色谱分离类黑精

5.3.5 半制备RP-HPLC 分离类黑精

5.3.6 RP-HPLC 分析类黑精

5.3.7 清除DPPH·自由基活性分析

5.3.8 对过氧化氢（H202）氧化损伤的PC12 细胞保护作用

5.3.9 相对分子质量分布测定

5.3.10 氨基酸组成分析

5.3.11 MALDI-TOF MS 质谱测定类黑精质量指纹图谱

5.3.12 ESI-MS-MS 质谱分析特征肽段氨基酸序列

5.3.13 红外光谱分析

5.3.14 类黑精组分的酸水解

5.3.15 半制备RP-HPLC 分离酸水解样品中色素组分

5.3.16 RP-HPLC 分析酸水解样品中色素组分

5.3.17 核磁共振（NMR）分析

5.4 结果与讨论

5.4.1 丝胶酶解产物中类黑精的形成

5.4.1.1 丝胶糖蛋白的性质

5.4.1.2 丝胶酶解产物中挥发性杂环化合物

5.4.2 丝胶酶解产物中类黑精的分离纯化

5.4.2.1 聚酰胺柱层析分离纯化DK-3 组分

5.4.2.2 RP-HPLC 分离纯化P-2 组分

5.4.3 RP-M 类黑精组分抗氧化活性

5.4.3.1 清除DPPH·自由基的能力

2O₂）氧化损伤的PC12 细胞保护作用'>5.4.3.2 RP-M 类黑精组分对过氧化氢（H₂O₂）氧化损伤的PC12 细胞保护作用

5.4.4 RP-M 类黑精组分相对分子质量

5.4.5 RP-M 类黑精组分氨基酸组成

5.4.6 RP-M 类黑精组分质量指纹图谱

5.4.7 RP-M 类黑精组分的结构特征

5.4.7.1 ESI-MS-MS 解析RP-M 类黑精组分中特征短肽的氨基酸序列

5.4.7.2 RP-M 类黑精组分的红外光谱

5.4.7.3 RP-M 类黑精组分的紫外－可见吸收光谱

5.4.8 酸水解样品中色素组分的分离及结构特征的分析

5.5 本章小结

参考文献

第六章丝胶肽抗衰老作用的研究

6.1 前言

6.2 实验材料与设备

6.2.1 实验材料和主要试剂

6.2.1.1 实验动物

6.2.1.2 实验材料

6.2.1.3 主要试剂

6.2.2 仪器设备

6.3 实验方法

6.3.1 动物分组、造模及给药

6.3.2 水迷宫实验

6.3.3 血清中SOD 活力和MDA 含量的测定

6.3.4 脏器系数测定

6.3.5 大鼠脑组织海马区组织形态学的观察（HE 染色）

6.3.6 大鼠脑组织中Bcl-2 mRNA 表达水平的半定量RT-PCR 分析

6.3.6.1 大鼠脑组织取材

6.3.6.2 组织中总RNA 的抽提

6.3.6.3 PCR 引物序列及扩增片断长度

6.3.6.4 RT-PCR 反应

6.3.6.5 目的片断的扩增

6.3.7 数据统计学处理

6.4 结果与讨论

6.4.1 丝胶肽对D-半乳糖致衰老模型老鼠血清中SOD 活性和MDA 含量的影响

6.4.2 丝胶肽对D-半乳糖致衰老模型老鼠免疫器官重量的影响

6.4.3 丝胶肽对D-半乳糖致衰老模型老鼠脑组织老化的影响

6.4.3.1 丝胶肽对D-半乳糖致衰老模型老鼠学习记忆能力的影响

6.4.3.2 丝胶肽对D-半乳糖致衰老模型老鼠脑组织海马神经细胞形态学的影响

6.4.3.3 丝胶肽对D-半乳糖致衰老模型老鼠脑组织Bcl-2 mRNA 表达的影响

6.5 本章小结

参考文献

主要结论

展望

论文创新点

致谢

附录：作者攻读博士学位期间发表的论文

丝胶肽的制备及其生物活性功能和结构的研究

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