论文摘要
目的:恶性肿瘤已经成为严重危害全球人类健康的常见致命性疾病之一。据资料统计,全世界每年有约700万人患癌症,大约有500万人死于癌症。在我国,恶性肿瘤的发病率和死亡率都呈增加的趋势。由于恶性肿瘤的病因至今尚未完全清楚,因此,目前临床上恶性肿瘤的治疗主要是采用手术、放疗、化疗、生物治疗（包括免疫治疗）等综合治疗手段,其中化疗已经成为各种晚期恶性肿瘤有效治疗的基础。一般认为细胞毒性化疗药物杀伤或抑制肿瘤细胞的疗效与剂量成正比,呈剂量依赖性关系。根据药理学研究成果制定的肿瘤大剂量化疗方案虽然有成功治愈绒毛膜上皮癌等恶性肿瘤的临床报道,但大剂量化疗对多数恶性肿瘤的五年存活率却无明显提高。一般认为肿瘤患者大剂量化疗后可获得较好的瘤体缩小的短期疗效,同时剂量依赖性的毒副作用也明显,往往不利于恶性肿瘤患者生存质量的改善和远期疗效的提高。随着医学模式的转变,学术界已逐渐认识到生存质量和生存期的延长对肿瘤病人有着决定性意义,而瘤体缩小只是治疗评价中的次要结局指标。而在目前的抗恶性肿瘤药物中,无论是细胞周期特异性药物还是细胞周期非特异性药物,其对癌细胞的杀伤作用都服从一级动力学原理即只能按比例而不能全部杀伤肿瘤细胞。因此,与化疗治愈肿瘤密切相关的机体因素还不十分清楚,化疗药物治愈肿瘤的作用机制尚有待于进一步研究。为深入研究化疗治愈肿瘤的作用机制,本研究利用荷膀胱癌小鼠模型,建立单一剂量化疗药物治愈荷瘤小鼠的动物模型。在此基础上,检测在单一剂量化疗药物治愈肿瘤过程中荷瘤小鼠外周血象的动态变化,分析外周血象的变化与荷瘤小鼠化疗疗效之间的关系,了解血小板包括外周血血小板计数和血浆血小板激活因子（platelet activating factor, PAF）水平在化疗治愈肿瘤中的变化及其意义。利用该化疗治愈荷瘤小鼠的动物模型,进一步通过透射电镜观察化疗药物体内治疗72小时后荷瘤小鼠肿瘤组织细胞的形态学变化,明确该化疗药物对肿瘤细胞及肿瘤间质细胞（特别是肿瘤血管内皮细胞）的作用机制;并且分析药物体内治疗72 h内,荷瘤小鼠肿瘤组织内过氧化脂质降解产物丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量的变化,明确肿瘤组织内肿瘤细胞的损伤或死亡与肿瘤局部脂质过氧化损伤的关系;同时,检测药物体内治疗72 h内,荷瘤小鼠血浆内毒素含量和一氧化氮（Nitric Oxide, NO）含量的变化,为进一步明确小剂量化疗治愈肿瘤的作用机制奠定基础。方法:给正常T739小鼠皮下接种小鼠可移植性膀胱移行细胞癌组织,建立荷膀胱癌小鼠模型。取肿瘤接种后第7天的荷瘤小鼠,称重后随机分两组:治疗组和对照组。治疗组小鼠单次腹腔内注射不同剂量的化疗药物,包括环磷酰胺（cyclophosphamide,CTX）、丝裂霉素C（Mitomycin C, MMC）;对照组小鼠单次腹腔内注射等量生理盐水。用药后每1～3天观察一次各组荷瘤小鼠,并记录小鼠的体重和肿瘤结节的直径。当肿瘤直径接近或等于15 mm,视为治疗无效、并将小鼠处死。存活小鼠的肿瘤结节应小于15 mm或无瘤。找出能使T739荷瘤小鼠肿瘤消退所需化疗药物的最小使用剂量。如果治疗后荷瘤小鼠肿瘤结节渐缩小甚至消失,继续观察至少60天。肿瘤治愈的标准为:用单一剂量化疗药物治疗后,荷瘤小鼠肿瘤消退,并在随后的2个月内无复发。然后,再取12只肿瘤接种后第7天的荷瘤小鼠,随机分成两组,治疗组小鼠腹腔内注射能使荷瘤小鼠肿瘤消退所需最小剂量的化疗药物,对照组小鼠腹腔内注射等量生理盐水。分别在用药后6 h、用药后第2、4、9、14 d内眦静脉取血,肝素抗凝后立即进行血常规检测,比较两组荷瘤小鼠外周血红细胞（red blood cell, RBC）数、血红蛋白（hemoglobin, Hb）浓度、白细胞数和血小板（Platelet,PLT）参数的动态变化,分析荷瘤小鼠外周血象的变化与化疗疗效的相互关系。同时,建立液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography -Mass Spectrometer, LC/MS/MS）测定小鼠血浆PAF的方法,检测单剂量化疗药物用药后6 h血浆PAF水平的变化。最后,再取18只肿瘤接种后第7天的荷瘤小鼠,随机分组,治疗组小鼠腹腔内注射能使荷瘤小鼠肿瘤消退所需最小剂量的化疗药物,对照组小鼠腹腔内注射等量生理盐水。CTX用药后6、24、48、72 h荷瘤小鼠内眦静脉取血,肝素抗凝后取血浆。应用BET-16细菌内毒素测定仪,采用动态浊度鲎试剂法检测荷瘤小鼠血浆内毒素水平;采用硝酸还原酶法测定荷瘤小鼠血浆NO浓度。随后将小鼠处死,肿瘤组织制成10%肿瘤组织匀浆,硫代巴比妥酸法检测肿瘤组织中MDA的含量。CTX用药后72 h,荷瘤小鼠处死后快速取肿瘤组织切成1.5 mm×2 mm大小,4%戊二醛固定后透射电镜观察肿瘤组织细胞的形态学变化。结果:1.小剂量CTX治愈荷瘤T739小鼠动物模型的建立接种2 mm3的小鼠膀胱癌肿瘤组织可使T739小鼠皮下肿瘤结节进行性生长。接种后第7天肿瘤结节直径约为2～4 mm。取肿瘤接种后第7天的荷瘤小鼠,1～16 mg/kg的MMC或15～400 mg/kg的CTX单次腹腔内注射。结果发现:（1）不同剂量的MMC用药后1 w,随MMC使用剂量的增加荷瘤小鼠化疗的毒副作用加大、肿瘤结节缩小的程度增加;MMC用药后2月,8～16 mg/Kg MMC治疗组和对照组荷瘤小鼠全部死亡,4 mg/kg和1 mg/kg MMC治疗组各有25%的荷瘤小鼠存活。（2）不同剂量的CTX用药后2 w,随CTX用药剂量的增加荷瘤小鼠化疗的毒副作用加大、肿瘤结节缩小的程度增加;CTX用药后2月,100～200 mg/kg CTX治疗组和对照组的荷瘤小鼠全部死亡,40 mg/kg CTX治疗后20%的荷瘤小鼠存活,15 mg/kg CTX治疗组60%的荷瘤小鼠存活,其与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。结果提示:15 mg/kg CTX是可治愈多数荷瘤T739小鼠所需CTX的最小有效剂量。2.外周血象和血小板激活因子在单剂量CTX治愈荷瘤小鼠过程中的变化及其意义15 mg/kg CTX对荷瘤小鼠外周血象无明显抑制作用。具体表现在:15 mg/kg CTX单次腹腔内注射后6 h,荷瘤小鼠外周血RBC计数（red blood cell count, RBC count）、血红蛋白（hemoglobin, Hb）浓度和WBC计数（white blood cell count, WBC count）分别为（9.86±0.64）×1012/L、166.6±15.2 g/L和（12.38±3.96）×109/L,与对照组荷瘤小鼠（9.0±0.6）×1012/L、148±10 g/L和（10.54±1.74）×109/L比较,差异无统计学意义（P>0.05）;CTX治疗后6 h荷瘤小鼠外周血血小板计数（ platelet count, PLT count）为（1483.4±184.4）×109/L,与对照组（1086.6±81.0）×109/L比较,差异具有统计学意义（P<0.01）;而血小板平均容积（mean platelet volume, MPV）、血小板分布宽度（platelet volume distribution width, PDW）和大血小板比率（platelet-large-cell ratio, P-LCR）与治疗组荷瘤小鼠比较差异无统计学意义（P>0.05）。用药后第2、4、9、14天治疗组荷瘤小鼠外周血RBC、WBC计数和PLT参数的变化与对照组小鼠比较差异无统计学意义（P>0.05）。进一步通过建立液相色谱-串联质谱测定小鼠血浆PAF的方法,检测了15 mg/kg CTX用药后6 h荷瘤小鼠血浆PAF水平的变化,结果发现:CTX治疗组荷瘤小鼠血浆PAF质量浓度为113.98±14.38 ng/ml,而对照组荷瘤小鼠血浆PAF质量浓度为58.34±13.89 ng/ml,两组数据比较差异具有统计学意义（P<0.01）。由此可以看出:在小剂量CTX用药后6 h,伴随荷瘤小鼠血小板计数的增加血浆PAF水平也明显提高,提示血小板在小剂量CTX治愈肿瘤过程中发挥重要作用。3.小剂量CTX抗肿瘤作用机制的研究小剂量CTX治疗后72 h,透射电镜下荷瘤小鼠肿瘤组织中肿瘤细胞以“凋亡”改变为主,具体表现在:肿瘤细胞体积变小,胞膜起泡或出“芽”,细胞表面突起减少、微绒毛减少甚至消失,相邻细胞间的细胞连接消失,染色质团块状散布核内并边集于核膜下,细胞核固缩呈不均一的块状结构,胞质内可见脂肪堆积,空泡变性等凋亡的特征性变化。同时,肿瘤组织中血管内皮细胞也出现典型的凋亡形态学变化,并伴随肿瘤毛细血管管腔的缩小。此外,肿瘤组织中还见部分肿瘤细胞细胞膜的完整性破坏,出现细胞坏死的形态学变化。电镜结果表明:小剂量CTX治疗后72 h,荷瘤小鼠肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡和肿瘤细胞坏死同时存在;同时,肿瘤血管内皮细胞也出现典型的凋亡改变。通过检测荷瘤小鼠肿瘤组织匀浆中脂质过氧化产物MDA的含量,结果发现:小剂量CTX用药后6 h,荷瘤小鼠肿瘤组织匀浆中MDA的浓度为14.69±3.86 nmol/mgprot,与对照组荷瘤小鼠16.1±1.35 nmol/mgprot比较差异无统计学意义（p>0.05）, CTX用药后24、48、72 h荷瘤小鼠肿瘤组织匀浆中MDA浓度较对照组明显降低,分别为8.87±2.70、5.15±2.13和8.92±2.94 nmol/mgprot,提示小剂量CTX治疗后72 h内,荷瘤小鼠肿瘤组织内过氧化脂质降解产物MDA的含量无明显升高,说明肿瘤细胞的损伤或死亡与肿瘤局部的脂质过氧化反应无关。通过检测15 mg/kg CTX用药后荷瘤小鼠血浆NO含量,结果发现:CTX用药后6 h,荷瘤小鼠血浆NO含量为60.93±5.59μmol/ml,略高于对照组小鼠34.88±19.08μmol/ml,CTX用药后72 h,血浆NO含量升至81.86±17.33μmol/ml,与对照组荷瘤小鼠比较差异具有统计学意义（p<0.01）。提示小剂量CTX用药后6～72 h血浆NO含量逐渐升高,说明血浆NO在小剂量CTX治愈肿瘤过程中发挥重要作用。最后我们检测了小剂量CTX用药后6 h荷瘤小鼠血浆内毒素含量,结果发现CTX治疗组荷瘤小鼠血浆内毒素含量为0.29±0.38 Eu/ml,明显低于对照组荷瘤小鼠1.20±0.72 Eu/ml（p<0.05）,提示15 mg/kg CTX用药后6 h荷瘤小鼠未出现内毒素血症。结论:1. 15 mg/kg CTX单次腹腔内注射可治愈多数荷膀胱癌T739小鼠,提示单一剂量CTX治愈荷瘤T739小鼠模型成功建立。2. 15 mg/kg CTX单次腹腔内注射在治愈多数荷瘤小鼠的同时对荷瘤小鼠的外周血象无明显抑制作用。CTX用药后6 h,荷瘤小鼠外周血血小板计数和血浆PAF水平明显高于对照组,提示血小板可能在化疗治愈肿瘤发挥重要作用。3.小剂量CTX体内治疗可诱导荷瘤小鼠肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的凋亡,而肿瘤细胞的坏死可能与肿瘤血管内皮细胞的损伤有关。小剂量CTX用药后72 h内,荷瘤小鼠肿瘤组织内MDA含量的逐渐下降,提示肿瘤细胞的死亡与氧化应激损伤无关。小剂量CTX用药后6 h,荷瘤小鼠体内未出现内毒素血症,CTX用药后72 h内血浆NO含量的持续增高与可能CTX用药后血浆PAF水平的升高和肿瘤血管内皮细胞的损伤有关。