海参体壁组织蛋白酶L的分离纯化及酶学性质的研究

论文摘要

海参是一种非常重要的水产经济动物,具有很高的营养和药用价值,海参的养殖及相关功能食品的开发日益受到关注。多种理化因素造成的海参自溶是新鲜海参保存、运输与加工过程中难以克服的主要问题。存在于海参体壁中的一系列内源性组织蛋白酶是海参自溶的主导因素,研究海参组织蛋白酶的酶学性质是调控和利用其自溶过程的重要前提。本文进行了海参体壁组织蛋白酶L的提取,纯化及酶学性质的研究。确定了海参体壁组织蛋白酶L的提取条件；采用阴离子交换层析、凝胶层析法对该酶进行了分离纯化；并利用SDS-PAGE电泳鉴定了该酶的分子量；研究了提纯酶的酶学性质。实验结果表明,海参体壁组织蛋白酶L的最佳提取条件为：含5mmol/L半胱氨酸、1mmol/L EDTA、0.2%Triton X-100的NaAc-HAc （50mmol/L, pH5.0）缓冲液；硫酸铵饱和度为80%。经DEAE Sepharose CL-6B.Sephadex G-75和TSK-GEL后,酶的纯度为最初的42.81倍,经SDS-PAGE测定分子量约为63kDa, Z-Phe-Arg-NMec为该酶的特异性底物,水解该底物Km和kcat砒值分别为69.92μM和12.80/S。提纯酶的最适反应pH和温度分别为5.0和50℃,不高于50℃下酶活力稳定。结果显示,Ca2+、Mg2+对该酶抑制不显著,Fe2+、K+、Mn2+对该酶有一定的抑制作用,Cu2+、Zn2+则能完全抑制该酶的活性。巯基抑制剂E-64和碘乙酸对酶完全抑制,相反巯基激活剂DTT和EDTA对酶有一定的激活作用,说明该酶为含巯基的蛋白酶。丝氨酸蛋白酶抑制剂（PMSF、TI）和金属蛋白酶抑制剂（1,10-菲啰啉）对酶有部分抑制。作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的亮抑酶肽和抗痛素有效抑制了酶的活性,说明该酶属于半胱氨酸蛋白酶且含有巯基。上述结果充分证明分离纯化所得蛋白为组织蛋白酶L,且很可能以酶-抑制剂或者酶原形式存

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 海参
• 1.1.1 海参概述
• 1.1.2 海参体壁结构及成分
• 1.1.3 海参的营养成分及其生物活性
• 1.1.3.1 胶原蛋白
• 1.1.3.2 多糖
• 1.1.3.3 甾醇
• 1.1.3.4 其它
• 1.2 自溶和组织自溶酶
• 1.2.1 内源蛋白酶
• 1.2.2 内源蛋白酶的分类
• 1.2.3 内源水解酶的作用
• 1.3 组织蛋白酶
• 1.3.1 组织蛋白酶的研究进展
• 1.3.2 组织蛋白酶的结构
• 1.3.3 组织蛋白酶的存在形式
• 1.3.3.1 组织蛋白酶的内源抑制剂复合物形式
• 1.3.3.2 组织蛋白酶的前体及其活性中间体形式
• 1.4 组织蛋白酶L
• 1.4.1 组织蛋白酶L的特征
• 1.4.2 组织蛋白酶L的研究进展
• 1.5 本课题的主要研究思路和内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验原料
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 主要实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 原料的预处理
• 2.2.2 蛋白质含量的测定
• 2.2.2.1 Lowry法测定蛋白质含量
• 2.2.2.2 紫外分光光度法测定蛋白质含量
• 2.2.3 组织蛋白酶L酶活力的测定
• 2.2.3.1 紫外光谱法确定底物标准品NMec的最大吸光度值
• 2.2.3.2 荧光光谱法确定NMec最大荧光强度值
• 2.2.3.3 NMec标准曲线的绘制
• 2.2.3.4 酶活力的测定
• 2.2.4 UV诱导海参自溶过程中体壁组织蛋白酶L活性的变化
• 2.2.5 组织蛋白酶L提取条件的确定
• 2.2.5.1 pH和离子强度对组织蛋白酶L提取率的影响
• 2.2.5.2 硫酸铵饱和度对组织蛋白酶L提取率的影响
• 2.2.5.3 酶液的透析和浓缩
• 2.2.6 海参体壁组织蛋白酶L的分离纯化
• 2.2.6.1 DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换层析
• 2.2.6.2 Sephadex G-75凝胶层析
• 2.2.6.3 TSK-GEL分子排阻色谱
• 2.2.7 分子量的测定
• 2.2.7.1 标准曲线的绘制
• 2.2.7.2 SDS-PAGE电泳
• 2.2.8 酶学性质的研究
• 2.2.8.1 最适反应pH的测定
• 2.2.8.2 最适反应温度的测定
• 2.2.8.3 热稳定性测定
• 2.2.8.4 金属离子对酶活力的影响
• 2.2.8.5 抑制剂和激活剂对酶活力的影响
• 2.2.9 组织蛋白酶L底物特异性的研究
• 2.2.10 组织蛋白酶L反应动力学的研究
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 标准曲线的绘制
• 3.1.1 蛋白质标准曲线的绘制
• 3.1.2 NMec标准曲线的绘制
• 3.1.2.1 紫外光谱法确定底物标准品NMec的最大吸光度值
• 3.1.2.2 荧光光谱法确定NMec的最大荧光强度值
• 3.1.2.3 NMec标准曲线
• 3.2 UV诱导海参自溶过程中体壁组织蛋白酶L活性的变化
• 3.3 组织蛋白酶L提取条件的确定
• 3.3.1 pH和离子强度对组织蛋白酶L提取率的影响
• 3.3.2 硫酸铵饱和度对组织蛋白酶L提取率的影响
• 3.4 组织蛋白酶L的分离纯化
• 3.4.1 DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换层析
• 3.4.2 Sephadex G-75凝胶层析
• 3.4.3 TSK-GEL分子排阻色谱
• 3.5 分子量的测定
• 3.5.1 标准曲线的绘制
• 3.5.2 分子量的测定
• 3.6 酶学性质的研究
• 3.6.1 最适反应pH的确定
• 3.6.2 最适反应温度的确定
• 3.6.3 热稳定性的确定
• 3.6.4 金属离子对酶活力的影响
• 3.6.5 抑制剂和激活剂对组织蛋白酶L的作用
• 3.7 组织蛋白酶L底物特异性的研究
• 3.8 组织蛋白酶L动力学参数的测定
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录