胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离

论文摘要

本研究以猪不同类型的细胞为供核细胞,体外成熟去核卵母细胞为受体胞质在体外构建胚胎,建立了体外生产体细胞核移植胚胎的技术体系,为体细胞克隆猪及核移植源胚胎干细胞（ntESCs）系的分离提供良好的平台。论文主要从以下5个方面进行了研究:1.供核细胞的准备共从4例胎儿肌肉组织中分离得到4个猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts, pFF）株,从1例新生猪耳组织中用组织块培养法分离得到一个耳部皮肤成纤维细胞（porcine ear skin fibroblasts, pESF）株,从3例胎猪骨髓中分离得到3个胎猪骨髓间充质干细胞（porcine fetal mesenchymal stem cells, pFMSCs）株。将15代的pFF、pESF及pFMSCs分别进行冷冻保存,解冻复苏后形态及活力没有明显变化。pFMSCs形态为成纤维样,呈长梭形,连续传13代后形态没有明显改变。传代培养的pFMSCs生长潜伏期为12 d ,之后进入对数增殖期,接种后的第6天进入平台期。透射电镜分析表明,pFMSCs细胞核质比高,胞浆中细胞器少。核型分析表明,pFMSCs具有正常的核型（2n=38,XY）。流式细胞仪检测显示,pFMSCs表达细胞表面抗原CD44,CD166,CD105,CD117,不表达CD45,CD90,CD11a,CD14。在β-巯基乙醇作用下,pFMSCs可诱导分化为神经样细胞,Nestin染色阳性。经血清饥饿和接触抑制处理的pFMSCs,流式细胞仪检测G0/G1期的细胞分别为86.72%和88.44%。以上细胞的分离培养为猪体细胞核移植相关研究打下了基础。2.猪卵母细胞体外成熟培养体系的建立从屠宰场采集猪卵巢,选择颗粒细胞层数2层以上、胞质均一的COCs进行体外成熟培养,对培养液组份进行了比较发现:①mM199组猪卵母细胞成熟率显著高于M199组（71.7% vs 59.7%）（p<0.05）,mM199组和M199组较NCSU-23组（43.6%）均能显著提高卵母细胞的成熟率（p<0.01）。②PMSG+hCG+FSH组卵母细胞成熟率略高于FSH+LH组,二组卵母细胞成熟率显著高于hMG组（p<0.01）。③分别添加FBS和PFF与对照组（分别不添加FBS和PFF）成熟率无统计学上的差异,但电激活后,均能显著提高卵裂率（p<0.05）,桑囊率二者无显著差异（p>0.05）。④单独添加EGF和联合添加EGF和ITS卵母细胞成熟率较不添加组稍有提高。电激活后,均能显著提高桑囊率（p<0.05）。⑤选择颗粒细胞层数3层以上的COCs可以显著提高卵母细胞体外成熟率

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 体细胞核移植经典回顾
• 1.1 核移植设想的提出及付诸行动
• 1.2 胚胎细胞核移植
• 1.3 胚胎干细胞核移植
• 1.4 体细胞核移植
• 1.5 异种细胞核移植
• 1.6 国内体细胞核移植研究现状
• 第二章 体细胞核移植理论基础
• 2.1 供核基因表达的变化
• 2.2 表观遗传修饰类型
• 2.2.1 DNA 甲基化
• 2.2.2 组蛋白乙酰化
• 2.2.3 其他组蛋白修饰方式
• 2.3 正常发育过程中表观遗传编程
• 2.3.1 合子前期
• 2.3.2 受精卵
• 2.3.3 植入前期
• 2.4 克隆过程表观遗传重编程
• 2.4.1 DNA 甲基化与去甲基化及其他方式
• 2.4.2 印迹基因表达
• 2.4.3 X 染色体失活和端粒长度调整
• 2.5 核移植效率低的主要原因
• 2.5.1 核不完全重编程
• 2.5.2 克隆胚胎缺陷
• 第三章 影响猪卵母细胞体外成熟的因素
• 3.1 猪卵母细胞减数分裂成熟的机理
• 3.2 影响猪卵母细胞体外成熟的因素
• 3.2.1 猪的品种
• 3.2.2 年龄及健康状态
• 3.2.3 营养状态
• 3.2.4 卵泡的大小
• 3.2.5 卵巢运输温度
• 3.2.6 卵丘细胞
• 3.2.7 体外培养时间
• 3.2.8 添加物
• 3.2.9 渗透压
• 3.2.10 水
• 3.2.11 其他
• 3.3 猪卵母细胞体外成熟的主要培养液
• 第四章 猪体细胞核移植技术体系
• 4.1 成功体细胞克隆猪简要回顾
• 4.2 供核细胞的准备
• 4.2.1 供体细胞类型对核移植效率的影响
• 4.2.2 供核细胞的周期
• 4.2.3 供核细胞的准备方案
• 4.3 受体卵母细胞的准备
• 4.4 核移植方法
• 4.4.1 融合法
• 4.4.2 胞质内注射法
• 4.4.3 无透明带显微操作法
• 4.4.4 “二步”核移植法
• 4.4.5 四倍体胚胎辅助法
• 4.4.6 损伤恢复核移植方法
• 4.5 卵母细胞去核方法
• 4.5.1 盲吸法
• 4.5.2 Hoechst33342 辅助法
• 4.5.3 Spindle-View 系统辅助法
• 4.5.4 挤压法
• 4.5.5 化学法
• 4.5.6 离心法
• 4.5.7 末期去核法
• 4.5.8 半卵法
• 4.5.9 功能性去核法
• 4.6 融合与激活
• 4.7 重构胚体外培养
• 4.7.1 微滴培养体系
• 4.7.2 孔中孔培养体系
• 4.7.3 明胶-孔系统
• 4.7.4 共培养系统
• 4.7.5 贯序培养系统
• 4.7.6 输卵管离体培养系统
• 4.8 胚胎移植
• 4.9 显微工具的制备
• 4.9.1 制针前玻璃管的处理
• 4.9.2 固定管的制作
• 4.9.3 去核针和注核针的制作
• 第五章 体细胞核移植技术的应用前景
• 5.1 体细胞核移植在生物医学上的应用
• 5.1.1 治疗性克隆
• 5.1.2 异种器官移植
• 5.1.3 生物反应器
• 5.2 体细胞核移植在克隆动物及其他领域中的应用
• 5.2.1 优良家畜的快速扩繁
• 5.2.2 转基因动物
• 5.2.3 克隆宠物
• 5.2.4 濒危及珍稀动物的保护
• 5.2.5 生物学基础研究
• 试验研究
• 前言
• 第六章 供核细胞的准备
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 试验材料与耗材
• 6.1.2 仪器设备
• 6.1.3 试验方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 供核细胞的分离、培养与冻存
• 6.2.2 胎猪骨髓间充质干细胞生长曲线
• 6.2.3 胎猪骨髓间充质干细胞表面标志的检测
• 6.2.4 胎猪骨髓间充质干细胞细胞周期
• 6.2.5 核型分析
• 6.2.6 胎猪骨髓间充质干细胞电镜观察
• 6.2.7 胎猪骨髓间充质干细胞向神经细胞诱导分化
• 6.3 讨论
• 6.3.1 pFF 及pESF 的分离与培养
• 6.3.2 关于胎猪骨髓间充质干细胞
• 6.3.3 供核细胞类型对克隆效率的影响
• 6.4 小结
• 第七章 猪卵母细胞体外成熟培养体系的建立
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 试验材料
• 7.1.2 试验方法
• 7.2 结果
• 7.2.1 培养基对猪卵母细胞体外成熟的影响
• 7.2.2 外源激素对猪卵母细胞体外成熟的影响
• 7.2.3 血清对猪卵母细胞体外成熟及电激活后孤雌胚胎发育的影响
• 7.2.4 猪卵泡液对猪卵母细胞体外成熟及电激活后孤雌胚胎发育的影响
• 7.2.5 表皮生长因子对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响
• 7.2.6 ITS 对猪卵母细胞体外成熟及电激活后孤雌胚胎发育的影响
• 7.2.7 颗粒细胞层数对猪卵母细胞体外成熟及电激活后孤雌胚胎发育的影响
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 第八章 猪卵母细胞孤雌激活的研究
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 试验材料
• 8.1.2 试验方法
• 8.2 结果
• 8.2.1 电场强度对猪孤雌胚胎发育能力的影响
• 8.2.2 不同脉冲时程对猪孤雌胚胎卵裂率及囊胚率的影响
• 8.2.3 不同的激活方法对猪卵母细胞发育能力的影响
• 8.2.4 不同的培养液对猪孤雌胚胎发育能力的影响
• 8.2.5 添加胰岛素对猪孤雌胚胎发育能力的影响
• 8.3 讨论
• 8.3.1 关于电激活参数
• 8.3.2 关于激活方法
• 8.3.3 关于孤雌激活后胚胎培养
• 8.4 小结
• 第九章 猪体细胞核移植的研究
• 9.1 材料与方法
• 9.1.1 材料
• 9.1.2 试验方法
• 9.2 结果
• 9.2.1 电场强度对猪重构胚体外发育的影响
• 9.2.2 血清饥饿处理对猪重构胚体外发育的影响
• 9.2.3 供核细胞代数对重构胚体外发育的影响
• 9.2.4 供核细胞类型对猪体细胞核移植效率的影响
• 9.2.5 核移植方法对猪体细胞核移植效率的影响
• 9.2.6 不同的培养液对猪体细胞核移植效率的影响
• 9.2.7 表皮生长因子和胰岛素对猪体细胞核移植影响
• 9.2.8 克隆胚移植情况
• 9.3 讨论
• 9.3.1 关于去核
• 9.3.2 电激活参数对猪体细胞核移植效率的影响
• 9.3.3 关于供核细胞
• 9.3.4 核移植方法对猪体细胞核移植效率的影响
• 9.3.5 关于培养液
• 9.3.6 克隆胚胚胎移植后妊娠的维持
• 9.4 小结
• 第十章 从猪孤雌激活及体细胞核移植囊胚中分离胚胎干细胞的初步探索
• 10.1 材料方法
• 10.1.1 材料
• 10.1.2 方法
• 10.2 结果
• 10.2.1 pPB 和pNTB 在饲养层上生长行为及类 ESCs 的分离培养
• 10.2.2 类pPESCs 和类pNTESCs 集落的形态学观察
• 10.2.3 类pPESCs 和类pNTESCs 分离效率的比较
• 10.2.4 类pPESCs 和类pNTESCs 的初步鉴定
• 10.3 讨论
• 10.3.1 胚胎干细胞分离培养方法
• 10.3.2 孤雌激活源胚胎干细胞
• 10.3.3 体细胞核移植源胚胎干细胞
• 10.3.4 关于如何提高pPESCs 和pNTESCs 的分离效率的探讨
• 10.4 小结
• 结论
• 本研究创新点
• 进一步研究的课题
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 致谢
• 个人简历