番茄热诱导型ftsH基因的分子克隆、表达特性及生理功能

论文摘要

FtsH蛋白酶是一种兼具ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侣活性的兼职蛋白,在生物体内具有重要功能。原核生物中的FtsH蛋白酶多为胁迫诱导型;在高等植物中,FtsH蛋白酶与光胁迫、低温以及病害等密切相关,但对其确切的作用机制尚不清楚。己在多种原核生物中发现热诱导的ftsH基因,而在高等植物中尚未见热诱导ftsH的报道。为此,我们构建了热诱导的番茄cDNA文库,通过EST分析从中分离出全长的ftsH基因,将其命名为LeftsH6。对其表达特性研究充分证明其热诱导表达特性;在此基础上,用反向PCR法克隆了该基因的启动子,通过凝胶阻滞和GUS表达分析研究该基因的表达调控特征。另外,我们构建了LeftsH6基因的过量、胞质定位（无前导序列的LeftsH6 cDNA）和反义的真核表达载体并转化番茄,获得了各种转基因株系,以确定番茄热诱导型FtsH的生理功能。主要实验结果如下:1.从热诱导的番茄cDNA文库中分离到全长ftsH基因并进行了特征分析。该基因序列全长2213 bp（注册号:AB217916）,包括一个2019 bp的读码框,推测的蛋白前体定位到叶绿体中,序列中存在AAA结构域和Zn2+结合结构域等已知的金属蛋白酶FtsH家族的特征结构域。在已克隆的基因中,该FtsH与拟南芥AtFtsH6最近源,被命名为LeftsH6。利用农杆菌侵染的方法将含有LeftsH6信号肽编码序列和gfp的融合基因转化烟草,GFP荧光表达分析发现:GFP在烟草表皮细胞的叶绿体中表达,证实LeftsH6基因具有叶绿体定位的特性。体外蛋白酶活性分析表明,纯化的FtsH具有蛋白水解活性,能降解酪蛋白但不降解BSA;突变的FtsH（Zn2+结合结构域中的谷氨酸Glu472突变为谷氨酰胺Gln）失去了体外蛋白酶活性。Southern杂交结果表明,该基因在番茄基因组中是单拷贝;Northern和Western杂交均表明该基因表达被热诱导,但其表达不被低温、干旱、盐胁迫、高光等胁迫调节。本研究首次证明了高等植物中存在热诱导的ftsH基因。2.用反向PCR法从番茄基因组中克隆了LeftsH6基因翻译起始位点上游1558 bp的启动子序列（注册号:AB218274）,序列分析表明该启动子中除含有典型的TATA盒和CAAT盒之外,还含有几组比较典型的热激元件（HSE）。利用原核诱导表达的热激转录因子HsfA2和放射性标记的ftsH启动子片段（包含HSE）进行凝胶阻滞实验,证实LeftsH6启动子中的HSE具有与热激转录因子特异结合的能力。将LeftsH6启动子1558 bp、587 bp和332 bp的片段与gus报告基因融合构建真核表达载体（pF1558、pF587、pF332）,转化烟草。对pF1558转基因烟草GUS活性检测

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略表
• 第一部分 文献综述
• 1 高温胁迫与热激蛋白
• 1.1 热激蛋白的种类、分布
• 1.2 热激蛋白的生理功能
• 1.3 HSP 基因的表达调控
• 1.4 热激反应研究展望
• 2 高温胁迫与蛋白酶
• 2.1 蛋白酶的种类、分布
• 2.2 AAA+蛋白家族
• 3 金属蛋白酶FtsH 研究进展
• 3.1 FtsH 的发现和分布
• 3.2 FtsH 基因组学特性
• 3.3 FtsH 的结构
• 3.4 FtsH 的生物学功能
• 3.5 FtsH 作用机制
• 3.6 问题与展望
• 第二部分 实验论文
• 第一章 番茄ftsH cDNA 的克隆与表达特性分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 番茄ftsH cDNA 的分离与序列分析
• 2.2 番茄植株生长与逆境处理
• 2.3 质粒提取与转化
• 2.4 FtsH 蛋白的原核表达、纯化与酶活性分析
• 2.5 植物DNA 提取与Southern 杂交分析
• 2.6 Northern 杂交
• 2.7 Western 杂交
• 2.8 FtsH 蛋白的亚细胞定位
• 3 结果与分析
• 3.1 番茄ftsH 基因的克隆与序列分析
• 3.2 LeFtsH6 蛋白的亚细胞定位
• 3.3 LeFtsH6 体外蛋白酶活性分析
• 3.4 LeftsH6 基因在番茄基因组中的Southern 杂交分析
• 3.5 LeftsH6 基因的表达特性
• 3.6 LeFtsH6 蛋白在热激胁迫下的积累
• 4 讨论
• 4.1 LeftsH6 基因的热诱导表达特征
• 4.2 LeFtsH6 蛋白的底物特异性
• 第二章 番茄LeftsH6 基因启动子的克隆与分析
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 Southern 杂交确定酶切图谱
• 2.2 基因组DNA 的酶切、回收与连接
• 2.3 反向PCR
• 2.4 启动子序列的克隆与元件分析
• 2.5 凝胶阻滞实验
• 2.6 GUS 表达载体的构建
• 2.7 烟草的遗传转化
• 2.8 转基因烟草的PCR 检测
• 2.9 GUS 活性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 LeftsH6 基因启动子的克隆
• 3.2 LeftsH6 启动子元件分析
• 3.3 HSF 与HSE 元件的结合活性
• 3.4 LeftsH6 启动子驱动的GUS 表达活性分析
• 4 讨论
• 4.1 热诱导ftsH 基因的调节模式
• 4.2 LeftsH6 在花发育过程中的表达
• 第三章 番茄LeFtsH6 蛋白酶与植物发育及耐热性的关系
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 植物表达载体的构建
• 2.2 番茄的遗传转化
• 2.3 转基因番茄的分子检测
• 2.4 转基因番茄植株的发育情况分析
• 2.5 转基因番茄植株的耐热性鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 LeftsH6 基因过量表达与番茄育性
• 3.2 胞质定位的LeftsH6 转基因番茄育性正常
• 3.3 反义抑制ftsH 基因表达与番茄耐热性
• 4 讨论
• 4.1 FtsH 蛋白酶家族的功能多样性
• 4.2 热诱导的LeFtsH6 蛋白酶在植物发育过程中的功能
• 总结
• 参考文献
• 攻读博士学位期间整理发表的论文及注册基因
• 致谢
• 图版