FSH对仔猪睾丸支持细胞GDNF表达调节的研究

论文摘要

正常成熟的精子是哺乳动物顺利完成生殖过程的必要条件。FSH是调节精子发生最重要的内分必因素之一，它通过调节支持细胞（Sertoli cell，SC）功能，间接刺激精子发生。研究表明，仔猪睾丸支持细胞胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）是调节精原细胞增殖分化的重要内部调节因子（Meng X，2000），GDNF由支持细胞分泌，受FSH调控（Tadokoro Y，2002）。本论文以原代培养仔猪睾丸支持细胞为实验模型，研究了FSH对GDNF表达的调节。 免疫组化（immunhistochemistry）研究结果发现：在幼龄阶段（2-4周龄），GDNT蛋白主要表达于间质细胞区，而在曲细精管内未见表达。从第2月龄开始，GDNF蛋白在曲细精管内的支持细胞胞浆出现阳性信号，呈较低水平表达。随着年龄的进一步增长，GDNF在睾丸曲细精管内的表达也不断增强，到成年时GDNF蛋白表达水平达最高。RT-PCR结果显示，仔猪出生后2周，睾丸中即存在GDNF mRNA的表达，随着年龄的增加，GDNF mRNA水平持续升高，到2月龄和6、18月龄分别与出生2周时有显著性（P<0.05）和极显著性（P<0.01）差异，其中第6月龄达高峰。实验结果表明，GDNF可能直接参与了出生后仔猪睾丸发育调节，并在调节精子发生中起着重要作用。 为了了解FSH对支持细胞GDNF蛋白的调控机制，我们以原代培养SC为实验模型，研究了FSH对SC增殖及其GDNF表达的影响。结果显示：（1）FSH可以延长SC的体外存活时间，促进SC的体外发育、贴壁和扩展，当FSH浓度为50ng／ml，作用48小时，其作用效果最强，证实FSH是早期仔猪SC培养时的必要添加成分。（2）FSH还促进了SC增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表达，FSH（50ng／ml）处理细胞15min，即可检测到PCNA；作用时间达30min时，PCNA的表达达显著水平；到2h，PCNA蛋白水平达到最高，随后逐渐降低。表明FSH促进SC增殖呈时间依赖性关系。（3）外源性添加FSH可促进GDNF蛋白表达，而且这种促进作用具有浓度和时间依赖关系：GDNF蛋白水平随着FSH浓度增加而升高，当FSH浓度为50ng／ml时，GDNF水平达到最高，然后逐渐降低；FSH（50ng／ml）作用30min，可显著促进GDNF蛋白的表达；当FSH作用1小时，GDNF蛋白水平达到最高，随后逐渐降低。 通过向体外培养的4周龄的仔猪睾丸支持细胞中加入信号通路中蛋白激酶的调节因子，研究了FSH对GDNF蛋白的调节作用及信号传导机制。实验结果表明：（1）FSH（50ng／ml）处理SC，可迅速激活MEK激酶，随FSH刺激时间的延长，ERK1／2活性逐渐升高（0-2h）；（2）dbcAMP（100μM）同样能迅速激活MEK激酶，诱导GDNF蛋白、mRNA的表达：ERK1／2活性的浓度随dbcAMP刺激时

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 精子发生
• 1.1 精子发生的环境
• 1.2 精子发生过程
• 1.3 支持细胞对精子发生的影响
• 1.4 精子发生的调控
• 2.GDNF家族及其受体
• 2.1 GDNF及GDNF家族简介
• 2.2 GDNF的基因结构
• 2.3 GDNF的蛋白质结构
• 2.4 GDNF的受体
• 2.5 GDNF信号传导
• 2.6 GDNF的组织分布和功能
• 3 GDNF与精子发生
• 3.1 GDNF及其受体在睾丸中的表达
• 3.2 精原干细胞的增殖与GDNF的作用机制
• 引言
• 第一章 GDNF在不同发育阶段猪睾丸的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂的配制
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 方法
• 1.5 数据分析
• 2 实验结果
• 2.1 睾丸重量与组织学分析
• 2.2 GDNF蛋白在不同发育阶段公猪睾丸中的表达
• 2.3 半定量RT-PCR
• 3 讨论
• 第二章 FSH对支持细胞GDNF表达的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试剂的配制
• 1.5 方法
• 1.6 统计分析
• 2 实验结果
• 2.1 支持细胞的分离与体外培养
• 2.2 FSH对支持细胞体外增殖的影响
• 2.3 FSH对支持细胞体外GDNF表达的影响
• 3 讨论
• 3.1 SC的分离和体外培养
• 3.2 FSH对体外培养的SC增殖的影响
• 3.3 FSH对支持细胞GDNF表达的影响
• 第三章 FSH调节GDNF蛋白表达的信号途径
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 试剂的配制与保存
• 1.4 主要设备
• 1.5 方法
• 1.6 统计分析
• 2 实验结果
• 2.1 FSH对ERK1／2活性的影响
• 2.2 dbcAMP对GDNF蛋白、mRNA的影响
• 2.3 dbcAMP对ERK1／2活性蛋白的影响
• 2.4 U0126和H89对FSH诱导的GDNF蛋白表达的影响
• 2.5 H89对FSH诱导的ERK1／2活性的影响
• 3 讨论
• 3.1 FSH刺激支持细胞GDNF蛋白表达的cAMP-PKA途径
• 3.2 FSH刺激支持细胞GDNF蛋白表达的MAPK途径
• 3.3 FSH调节支持细胞GDNF蛋白表达的信号通路
• 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 在读期间参加的课题和发表的论文