提高耐热链霉菌转化泰乐菌素能力的分子育种改造

论文摘要

乙酰异戊酰泰乐菌素（AIV）是一种高效的大环内酯类抗生素,有着很高的工业应用价值。它是通过耐热链霉菌生物转化泰乐菌素,在泰乐菌素的3-OH乙酰基化和4″-OH异戊酰基化而获得。本研究希望通过在耐热链霉菌中分别整合acyB1-B2基因、ermE基因和中断nsdA基因三个方面的分子改造,以提高泰乐菌素转化率。本研究首先通过摇瓶装量、转种量、种龄、发酵培养周期4个摇瓶发酵参数的研究,初步确定了耐热链霉菌摇瓶发酵的最佳工艺流程。出发菌株经二级种子培养24 h后,以10%的转种量,转种到35 mL发酵培养基,48 h后补加泰乐菌素和亮氨酸,补料48 h测转化率,出发菌株泰乐菌素转化率稳定在70%。AcyA负责乙酰基化功能,acyB1-B2负责异戊酰基化功能,acyB2基因是acyB1基因的正调控基因。本研究将acyB1-B2基因单独克隆出來,插入pIJ8600构建成整合表达载体pBIB425,导入耐热链霉菌工业菌株BIB0830中,得到重组菌株BIB425。HPLC分析表明,与出发菌株BIB0830相比,BIB425泰乐菌素转化率提高了14%。结果表明单独增加acyB1基因拷贝数不足以提高耐热链霉菌的异戊酰基化酶活,acyB2基因的激活作用在整个酰基化过程中至关重要。ErmE基因类似于carB基因,编码核糖体双甲基化酶。本研究以pIJ8600为出发菌株,构建了ermE（ermEp*）基因的整合表达载体pBIB304。通过属间接合转移,整合到BIB0830中,抗性筛选和PCR验证得到阳性克隆BIB304。结果表明重组菌株BIB304在固体平皿和液体YEME培养基中对泰乐菌素的耐受性均从100μg/mL提高到900μg/mL。在摇瓶水平上,导入红霉素的抗性基因对耐热链霉菌生物量和转化泰乐菌素无明显影响。本研究还对在链霉菌中普遍存在的负调控基因nsdA进行了研究。通过接合转移nsdA基因中断载体pBIB308,得到nsdA基因中断突变株BIB308。HPLC结果显示:在摇瓶水平上,BIB308的泰乐菌素转化率提高了22%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语（Abbreviations）
• 第一章 前言
• 1.1 弗氏链霉菌
• 1.1.1 简介
• 1.1.2 Tylosin生物合成
• 1.1.2.1 泰乐内酯的生物合成
• 1.1.2.2 泰乐内酯的后修饰（Post-PKS tailoring）
• 1.1.2.3 tylE和tylF甲基转移酶
• 1.1.2.4 tlrA、tlrB、tlrD和tlrC泰乐菌素抗性基因
• 1.1.2.5 泰乐菌素的生物调控
• 1.1.2.6 metF和metK辅助基因
• 1.2 泰乐菌素的衍生物
• 1.2.1 替米考星
• 1.2.1.1 替米考星概述
• 1.2.1.2 替米考星的抗菌活性
• 1.2.1.3 替米考星的毒性
• 1.2.1.4 替米考星的化学合成
• 1.2.2 乙酰异戊酰泰乐菌素（AIV）
• 1.3 耐热链霉菌
• 1.4 本课题研究依据、目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 PCR引物
• 2.1.4 培养基和生化试剂
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种培养及保藏
• 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的小量提取
• 2.2.3 大肠杆菌感受态的制备及质粒的化学转化
• 2.2.4 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测
• 2.2.5 链霉菌基因组DNA的少量快速提取
• 2.2.6 PCR反应体系
• 2.2.7 DNA片段的回收
• 2.2.8 载体的去磷酸化
• 2.2.9 DNA连接
• 2.2.10 大肠杆菌与链霉菌之间的属间接合转移
• 2.2.11 发酵培养
• 2.2.12 菌体浓度的测定
• 2.2.13 AIV的测定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 摇瓶发酵工艺优化
• 3.1.1 转种量对转化率的影响
• 3.1.2 摇瓶装量对转化率的影响
• 3.1.3 种龄对转化率影响
• 3.1.4 发酵培养周期对转化率影响
• 3.2 acyB1-B2基因的整合表达
• 3.2.1 构建acyB1-B2基因重组质粒
• 3.2.1.1 PCR克隆acyB1-B2基因
• 3.2.1.2 构建acyB1-B2基因表达载体
• 3.2.2 acyB1-B2基因重组质粒通过接合转移导入耐热链霉菌
• 3.2.3 阳性菌株的筛选和PCR验证
• 3.2.4 acyB1-B2基因整合表达对耐热链霉菌转化泰乐菌素的影响
• 3.3 红霉素抗性基因ermE的整合表达
• 3.3.1 构建ermE基因罩组质粒
• 3.3.2 ermE基因整合表达及验证
• 3.3.3 ermE基因整合表达对耐热链霉菌转化泰乐菌素的影响
• 3.3.3.1 ermE基因对生物转化泰乐菌素的影响
• 3.3.3.2 泰乐菌素耐受性影响
• 3.4 nsdA基因中断对耐热链霉菌转化泰乐菌素的影响
• 3.4.1 nsdA基因中断及其PCR验证
• 3.4.2 nsdA基因中断菌株形态变化和发酵产物的HPLC分析
• 第四章 总结与讨论
• 4.1 总结
• 4.2 讨论
• 4.3 展望
• 参考文献
• 致谢