利用乳酸乳球菌AcmA蛋白构建细菌表面展示体系及性能研究

论文摘要

本研究利用乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）全长肽聚糖水解酶AcmA及其氨基末端结构域作为锚定单元,分别在乳酸乳球菌和大肠杆菌（Eschericha coli）中构建了一个功能性展示外源蛋白的细胞表面展示系统,并对该系统展示活性进行了初步的分析研究。利用实验室筛选鉴定的一株乳酸乳球菌菌株MB191作为出发菌株,通过克隆该菌株携带的肽聚糖水解酶基因acmA,并经测序分析后,构建全长acmA与gfp的融合基因,再连接于经部分改造的大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭载体pMG36k,构建得到重组质粒pMB 137,然后经电转化导入乳酸乳球菌野生型菌株AS 1.2829后,筛选得到重组菌株MB137。经SDS-PAGE验证,重组菌可表达分子量约74kD的融合蛋白,与预期大小一致;并通过流式细胞免疫技术检测到细胞表面荧光,说明AcmA将GFP成功定位于乳酸乳球菌细胞表面。在此基础上,通过克隆了枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis）的β-葡聚糖酶基因gls,经测序分析后用于替代重组质粒pMB137中的gfp而构建得到重组质粒pMB138,通过DNS法测定所得到的重组菌株MB138的全细胞葡聚糖水解酶酶活力为12U/ml,较出发菌株具有明显水解酶活性。鉴于AcmA蛋白的氨基末端结构域与一种业已被研究证实、并广泛应用的革兰氏阴性菌细胞表面展示系统的运载蛋白—来自于丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的冰核蛋白（Icenucleation protein,INP）的氨基末端结构域具有一定程度上的相似性,为了进一步研究来自于革兰氏阳生菌的AcmA是否在革兰氏阴性菌中也具有细胞表面的定位活性,以期扩大其应用范围,本研究进一步扩增得到acmA基因N端结构域,并利用绿色荧光基因gfp作为报告基因,通过构建融合基因acmAn/gfp以及acmA/gfp,并连接至大肠杆菌表达载体pTrcHis-C,分别获得重组质粒pMB131（含acmAn/gfp）和pMB132（含acmA/gfp）,再将重组质粒转入大肠杆菌受体菌JM109后,分别得到重组菌MB131和MB132。将重组菌株诱导表达后,分别经过荧光显微镜镜检检测融和基因荧光活性、特异性蛋白酶及SDS敏感性试验、细胞分级分离后样品的Western-blot分析、特异GFP二抗荧光标记的流式细胞仪检测分析等实验,证实了GFP蛋白在大肠杆菌受体菌JM109细胞表面的定位。在此基础上,将所克隆的枯草芽胞杆菌葡聚糖酶基因gls代替gfp而构建重组质粒pMB133（含acmAn/gls）和pMB134（含acmA/gls）,在JM109细胞内进行了诱导表达,通过DNS法测定重组菌MB133以及MB134的全细胞酶活性,结果显示重组菌株具有明显的全细胞水解酶活性（酶活力分别为25U/ml和19U/ml）。本研究在国内外首次证实来自革兰氏阳性菌的肽聚糖水解酶AcmA具有在革兰氏阴性菌的大肠杆菌中的细胞表面定位和展示外源蛋白的活性,且截断的、仅保留其N端结构域的AcmA-N具有比全长AcmA更强的表面展示活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 微生物细胞表面展示技术研究进展
• 1.1.1 微生物细胞表面展示技术简介
• 1.1.2 运载蛋白
• 1.1.3 乘客蛋白
• 1.1.4 微生物细胞表面展示体系的种类
• 1.1.5 微生物细胞表面展示技术的应用现状
• 1.2 运载蛋白-ACMA（N-ACETYLMURAMINIDASE）
• 1.2.1 AcmA（N-Acetylmuraminidase）简介
• 1.2.2 AcmA在细胞表面展示方面的应用
• 1.3 乘客蛋白-B-1,3-1,4-葡聚糖酶
• 1.3.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶简介
• 1.3.2 来源
• 1.3.3 应用现状及前景
• 1.4 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 聚合酶链式反应引物
• 2.1.5 实验试剂及仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA提取
• 2.2.2 PCR扩增
• 2.2.3 DNA电泳分析
• 2.2.4 DNA片断的回收
• 2.2.5 转化
• 2.2.6 绿色荧光蛋白（GFP）荧光强度的检测
• 2.2.7 SDS-PAGE电泳以及Western-blot分析
• 2.2.8 蛋白酶敏感性实验
• 2.2.9 SDS以及EDTA敏感性实验
• 2.2.10 细胞免疫实验以及FACS分析
• 2.2.11 细胞分级分离
• 2.2.12 葡聚糖酶活性测定
• 2.2.13 质粒稳定性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 ACMA在乳酸乳球菌中表面展示活性及性能研究
• 3.1.1 acmA基因克隆及序列分析
• 3.1.2 含融合基因acmA/gfp的乳酸乳球菌表面展示载体构建
• 3.1.3 SDS-PAGE
• 3.1.4 荧光活性检测
• 3.1.5 免疫流式细胞技术检测乳酸乳球菌表面展示GFP性能
• 3.1.6 gls基因克隆及序列分析
• 3.1.7 乳酸乳球菌表面展示GLS载体构建
• 3.1.8 乳酸乳球菌表面展示GLS酶活测定
• 3.2 ACMA及N末端在大肠杆菌中表面展示性能研究
• 3.2.1 表面展示载体的构建及表达活性
• 3.2.2 AcmA及AcmA-N在大肠杆菌中表面展示GFP
• 3.2.3 AcmA及AcmA-N在大肠杆菌中表面展示GLS
• 3.2.4 质粒稳定性分析
• 4 小结和讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 4.2.1 基于AcmA的最优化表面展示体系
• 4.2.2 开发工业酶类的微生物来源以及生物杀菌剂
• 参考文献
• 致谢
• 附录