论文摘要
全氟异丁烯（perfluoroisobutylene, PFIB）是聚氟工业生产和加工过程中的副产物,每年有上万吨的产量。随着聚四氟乙烯制品的广泛使用,在火灾事故生成的有毒烟雾中,亦有PFIB的产生。PFIB毒性比光气约强10倍,可以穿透防毒面具。吸入少量的PFIB即可诱发急性肺损伤（acute lung injury, ALI）,严重者可以导致死亡。PFIB所致的ALI以肺顺应性降低,肺内分流增加及通气/血流比值失衡为病理生理学基础,临床表现为顽固性低氧血症、呼吸频数改变和呼吸窘迫,胸部X线显示双肺弥漫性浸润影,后期多并发多器官功能衰竭。迄今为止, PFIB致ALI的机制不完全清楚,有效药物和治疗措施缺乏。国内外及本实验室前期研究结果表明:早期,肺内中性粒细胞聚集、扣押及所诱发的过度炎症反应是关键环节;晚期,其他因素（如肺巨噬细胞）可能具有更重要的作用。在临床治疗上多局限于采用大剂量激素治疗,以及对症和支持治疗,治疗效果不理想,病死率高。本课题的目的是深入探讨PFIB吸入性肺损伤的发生、发展规律及其毒理学作用机制,从而为指导临床预防和治疗工作及相关药物的研发奠定理论基础。首先在整体动物的水平上从常规病理切片、肺气血屏障主要细胞超微结构、细胞连接和细胞骨架蛋白、肺组织细胞凋亡等层次上观察了PFIB染毒后肺气血屏障的病理改变。根据本室前期的研究结果成功制备了模拟PFIB吸入所致ALI临床典型病程的动物模型。Wistar大鼠（180-220 g）吸入亚致死剂量的PFIB（140 mg/m3, 5 min）后,肺湿/干比、湿肺/体比、干肺/体比、肺含水量4个肺系数指标及大鼠支气管肺泡灌洗液中白蛋白、总蛋白含量在4 h内与正常组相比没有明显的变化（早期损伤期）,8 h时开始显著升高,24 h达到峰值（肺水肿期）,随后逐渐下降,72 h基本恢复至正常水平（恢复期）。在上述模型上,大鼠肺组织病理切片,常规HE染色显示:正常大鼠肺泡组织结构完整,未见水肿、出血、蛋白渗出、炎性细胞浸润等改变。PFIB染毒后,4 h内未见明显的病理改变,8 h肺泡的完整性开始遭到破坏,并出现水肿、出血等病理改变,肺泡腔内有明显的蛋白渗出和炎性细胞浸润,24 h达到峰值后逐渐恢复至正常。透射电镜观察肺泡Ⅰ型上皮细胞（alveolar typeⅠepithelial cell, AT-Ⅰ）、肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡepithelial cell, AT-Ⅱ）、肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cell, PMVEC）、肺巨噬细胞（pulmonary macrophage, PM）的超微结构的病理变化,结果如下。正常的AT-Ⅰ是鳞状扁平样细胞,细胞核小而致密,细胞质薄,细胞器较少,偶见线粒体和糙面内质网。游离面有极少量粗短的微绒毛,侧面有紧密连接带与AT-Ⅱ细胞相连。PFIB染毒后30 min,AT-Ⅰ即出现病理变化:细胞核皱缩,染色质变致密;线粒体肿胀,基质均匀变浅,胞浆内有空泡出现。随时间延长,细胞核皱缩得更严重,染色质逐渐分成若干小块,并边缘化,核仁逐渐裂解;线粒体双层膜结构逐渐破坏,嵴肿大甚至断裂,胞浆内空泡增多。至24 h各种病理改变最严重,表现为细胞大量破碎,线粒体双层膜结构破坏严重,嵴甚至消失。24 h后逐渐改善至正常。正常的AT-Ⅱ呈立方形,细胞器比较丰富,有被锇酸染成黑色的板层体。PFIB染毒后其细胞形态学和线粒体病理变化规律与AT-Ⅰ基本一致。微绒毛病理变化如下:PFIB染毒后30 min,AT-Ⅱ微绒毛即发生损伤,随时间延长,微绒毛逐渐脱落。至24 h病理改变最严重。24 h后逐渐得到改善至正常。正常的PMVEC以紧密连接的方式覆盖在肺微血管的内表面,直接与血液接触,外形扁平,富含多种细胞器。PFIB染毒后30 min,PMVEC基膜即发生损伤,表现为肿胀、变形。随时间延长,基膜逐渐发生破损、断裂。至24 h病理改变最严重。24 h后逐渐改善至正常。PMVEC细胞形态学与线粒体变化规律与以上两种细胞基本一致。正常的PM体积较大,胞浆中含线粒体、溶酶体、包涵体等。仅在PFIB染毒后2 h观察到,PM细胞质中吞噬颗粒明显增多。PFIB染毒后,PM细胞形态学和线粒体病理变化规律与以上几种细胞基本一致。原位杂交法观察大鼠肺组织细胞凋亡随时间变化规律的结果显示,PFIB染毒后30 min,大鼠肺组织凋亡细胞的数量开始上升,24 h达到峰值,此后逐渐恢复至正常,与前述变化规律极其一致。紧密连接蛋白之一的Zonula occludens-1 （ ZO-1）的变化主要反映了PFIB染毒后细胞连接的破坏程度,与早期肺气血屏障的通透性增加有关,而中后期通透性增加则与细胞骨架蛋白之一的肌动蛋白的病理变化关系密切。应用间接免疫荧光法,观察ZO-1在PFIB染毒后的变化发现: ZO-1在PFIB染毒后30 min阳性着色点即有下降,24 h达最低点后逐渐恢复至正常;肌动蛋白在PFIB染毒后4 h阳性着色点没有明显的改变,8 h后开始有比较明显的下降,24 h达最低点后逐渐恢复至正常。Western-blot结果展示肌动蛋白的变化规律与间接免疫荧光法的结果基本一致。以上病理结果除PFIB直接损伤外,体内是否还有其他因素参与调节呢?近年研究认为,维持肺脏发挥正常功能的诸多因素之中,肺微血管内皮屏障结构与功能的状态,在各种原因所致ALI诱发的肺气血屏障功能缺陷病理生理过程中的地位更为突出。而肌球蛋白轻链磷酸化是调节肺微血管内皮屏障的关键性步骤。磷酸化的肌球蛋白轻链（myosin light chain, MLC）不仅破坏细胞间连接,而且诱发肌动蛋白张力丝重组,从而增加气血屏障的通透性。提高MLC磷酸化水平有两个主要途径:肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase, MLCK）途径和Rho激酶（Rho-kinase, ROCK）途径。前者通过促进MLC磷酸化,后者则是通过抑制MLC磷酸酶。由于MLCK途径能够直接增加MLC磷酸化的水平,目前研究的较多,地位也更重要。PFIB染毒后,间接免疫荧光法显示,MLCK阳性着色点在PFIB染毒后4 h内呈逐步增加的趋势,8 h时开始降低,24 h时降至最低点,然后出现回升。我们认为此结果可能是PFIB染毒后ZO-1和肌动蛋白变化规律的原因之一。如果以MLCK抑制剂ML-7 （用10%乙醇溶解,首次4.3 mg/kg bw i.p.随后1.4 mg/kg bw i.p. b.i.d连续给药两天）对实验动物进行预处理,PFIB染毒后所致急性肺水肿的程度显著降低,此时,Western-blot结果也显示,PFIB染毒后,在ALI发生、发展过程中出现的肌动蛋白降低现象得到明显缓解。由于整体动物影响因素较多,为深入探讨PFIB染毒后肺气血屏障主要功能细胞PMVEC和AT-Ⅱ结构和功能的病理变化规律,本实验进一步分离纯化出PMVEC和AT-Ⅱ,详细观察了PFIB染毒后这两种细胞的病理变化规律。采用整体实验PFIB（130 mg/m3, 5 min）的染毒条件,直接作用于体外培养的PMVEC和AT-Ⅱ时,两种细胞在72 h内的细胞存活率均大于95%。透射电镜超微结构观察显示:PMVEC在PFIB染毒后1 h,细胞核、线粒体均出现与整体动物染毒后一致的损伤,并有逐步增强的趋势,至24 h病理改变最严重,24 h后逐渐得到改善。应用凯基Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒和流式细胞仪观察了PFIB染毒后体外培养的PMVEC、AT-Ⅱ凋亡的发生及体外培养的AT-Ⅱ在PFIB染毒后的培养上清液对正常PMVEC的促凋亡作用和对PFIB染毒后的PMVEC的保护作用。PFIB染毒后1 h,两种细胞凋亡的数量明显增多,24 h内呈逐步增加的趋势,在24 h达到峰值后,逐渐恢复至正常。正常AT-Ⅱ的培养上清液对正常的PMVEC没有促凋亡作用。PFIB染毒后1 h的AT-Ⅱ的培养上清液对正常的PMVEC有明显的促凋亡作用,24 h内的AT-Ⅱ的培养上清液促凋亡作用逐渐增强,48 h后AT-Ⅱ的培养上清液基本没有促PMVEC的凋亡作用。PFIB染毒后,PMVEC凋亡数量明显增多。正常AT-Ⅱ的培养上清液对PFIB促PMVEC凋亡有明显的保护作用。而PFIB染毒后的AT-Ⅱ的培养上清液对PFIB促PMVEC凋亡的保护作用更明显。表现为:PFIB染毒后1 h的AT-Ⅱ的培养上清液的保护作用最强,PFIB染毒后24 h内的AT-Ⅱ的培养上清液的保护作用逐渐减弱,但24 h的AT-Ⅱ的培养上清液的保护作用仍强于正常的AT-Ⅱ的培养上清液的保护作用。48 h后的AT-Ⅱ的培养上清液的保护作用逐渐恢复。近年的研究表明,肺表面活性物质（PS）在肺防御保护机制中起重要作用,是肺内特有的生理性抗损伤因子之一。PS主要在AT-Ⅱ的胞浆内合成,储存在板层体内,磷脂是PS的主要成分。磷钼蓝比色法测定细胞培养上清液中总磷脂含量能间接反映PS含量的变化。PFIB染毒后1 h总磷脂含量即逐渐增加,4 h后开始逐渐下降,24 h降低到最低点,甚至显著低于正常AT-Ⅱ培养上清液中总磷脂含量,但48 h后,总磷脂含量逐渐恢复。此结果可以解释AT-Ⅱ的培养上清液对PFIB染毒后的PMVEC的保护作用。以上研究结果,全面而详细地描述了PFIB染毒后肺气血屏障及主要细胞的结构和功能的变化规律和机制,并初步探讨了肌球蛋白轻链激酶（MLCK）在PFIB诱发ALI中的变化规律及在其中的作用,为防治疾病提供了理论依据和策略。
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