绵羊甲状腺转录因子-1（TTF-1）基因克隆、序列分析及PCR-SSCP检测

论文摘要

甲状腺转录因子-1,是一种分子量为38KD的核蛋白,在动物胚胎期和发育成熟的甲状腺、肺上皮细胞中表达的一种转录因子。TTF-1对于调控甲状腺球蛋白（TG）、甲状腺过氧化物酶（TPO）和促甲状腺激素受体（TSHR）等基因启动子的转录活性具有重要作用。TTF-1基因还对哺乳动物的繁殖性能有潜在的影响。本研究首先从绵羊白细胞中提取基因组DNA,依据已发表的哺乳动物TTF-1基因序列设计三对特异性引物SP1/SP2、SP3/SP4和SP5 /SP6,采用PCR技术扩增基因组DNA,分别获得目的基因片段T1、T2、T3。通过T4DNA连接酶将目的基因连接于克隆载体pGEM-T的SacⅡ和SpeⅠ位点,构建质粒DNA文库。然后再经过DNA文库的筛选、感受态E.coli-DH5α的转染、质粒DNA的提取、限制性酶切分析以及测序分析后,成功克隆了绵羊TTF-1基因三部分片段,分别为T1（ACCESSION NO:DQ823383）、T2（ACCESSION NO:DQ010920）和T3。其中T1含有457个核苷酸,T2和T3（相互重叠的一部分合并后）含有375个核苷酸,分别编码106个和126个氨基酸残基组成的多肽。序列分析发现,T1片段的编码蛋白包含具有转录活性的结构域（N端）共73个氨基酸残基;T2和T3片段的编码蛋白包含NKX2转录因子家族绝对保守的同源序列共60个氨基酸残基。序列同源性分析表明,绵羊TTF-1基因的核酸和蛋白质序列在不同哺乳动物之间有很高的同源性,分子在进化上均相当保守。采用PCR-SSCP技术对TTF-1基因在不同品种绵羊群体间的DNA多态性检测表明,三个克隆片段的核苷酸序列在品种间没有差异。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一节 文献综述
• 1.1 绵羊多胎性的研究
• 1.1.1 目前研究和改良绵羊多胎性的方法和手段
• 1.1.2 绵羊多胎主基因国内外的研究现状
• 1.1.3 与繁殖性状能相关的TTF-1 基因的研究
• 1.2 转录因子
• 1.2.1 转录因子的分类
• 1.2.2 转录因子的作用机制
• 1.2.3 转录因子与基因表达
• 1.2.4 转录因子与动物疾病的关系
• 1.3 甲状腺转录因子-1（TTF-1）
• 1.3.1 TTF-1 概述
• 1.3.2 TTF-1 的结构
• 1.3.3 TTF-1 的生物学特性
• 1.3.4 TTF-1 的表达以及在人类肿瘤鉴别诊断中的应用
• 1.3.5 TTF-1 基因的分子生物学研究进展
• 1.4 生物信息学分析
• 1.4.1 核酸序列的同源性检索
• 1.4.2 比较基因组分析
• 1.5 本项目的研究意义
• 第二节 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物及血样
• 2.1.2 菌株与克隆载体
• 2.1.3 DNA 分析软件
• 2.1.4 试验仪器和试剂
• 2.1.4.1 主要仪器设备
• 2.1.4.2 药品和酶
• 2.1.4.3 溶液
• 2.1.4.4 试验用溶液的配制（详见附录二）
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 绵羊基因组DNA 的提取
• 2.2.2 绵羊TTF-1 基因的PCR 扩增与克隆测序
• 2.2.3 TTF-1 基因位点在不同繁殖力绵羊间的多态检测
• 2.2.3.1 目的条带的PCR 扩增
• 2.2.3.2 14%非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳
• 第三节 试验结果
• 3.1 绵羊基因组DNA 的提取
• 3.2 PCR 扩增结果
• 3.3 PCR 产物的克隆
• 3.3.1 阳性克隆的菌落PCR 鉴定
• 3.3.2 质粒的提取
• 3.3.3 阳性克隆的双酶切鉴定
• 3.4 DNA 测序结果
• 3.5 绵羊TTF-1 基因部分片段DNA 多态性检测结果
• 第四节 分析与讨论
• 4.1 TTF-1 基因片段的生物信息学分析
• 4.1.1 绵羊TTF-1 基因序列碱基分布和限制性酶切分析
• 4.1.2 绵羊TTF-1 基因核苷酸序列与其他哺乳动物的同源性和进化分析
• 4.1.3 绵羊TTF-1 基因编码的蛋白质序列预测
• 4.1.4 绵羊TTF-1 基因蛋白质序列与其它哺乳动物序列同源性和进化分析
• 4.1.5 绵羊TTF-1 基因编码的氨基酸残基序列结构域和保守区分析
• 4.2 TTF-1 基因与绵羊繁殖性能相关性多态检测的探讨
• 4.3 试验方法的探讨
• 4.3.1 DNA 的抽提
• 4.3.2 连接转化和克隆操作
• 第五节 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 导师简介
• 附录一 缩写表
• 附录二 实验相关溶液的配置
• 附