硝唑尼特在山羊体内的药物代谢动力学及毒理学研究

论文摘要

硝唑尼特（nitazoxanide, NTZ）是一种硝基噻唑苯胺类化合物,具有广谱抗微生物活性,对寄生虫,细菌以及病毒有效。体内活性与其脱乙酰基衍生物替唑尼特（tizoxanide, T）有关,具体包括细胞内外的原虫,蠕虫,需氧与厌氧菌,以及病毒。因此,进行硝唑尼特的药理学与毒理学研究将对其进一步开发及应用会产生重要的作用。我们首先建立了一种用于山羊粪便中硝唑尼特代谢物鉴定的敏感、特异的液相色谱电喷雾串联质谱（liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry, LC–ESI–MS–MS）方法,并且采用了ESI阴离子模式。样品经前处理后注入XTerra MS C8柱,试验过程中使用的流动相为乙腈（acetonitrile）与10 mM乙酸铵（ammonium acetate）,以0.2 ml/min的流速进行线性梯度洗脱（linear gradient elution）,随后进行MS–MS检测。代谢物鉴定以及结构解析通过比较原药或其它可用标准的保留时间（retention times, Rt）,全扫描,子离子扫描,母离子扫描与中性丢失扫描的MS–MS质谱图来完成。山羊按200 mg/kg的剂量经口给予硝唑尼特后,在其粪便中发现原药（nitazoxanide）及其脱乙酰基代谢物（替唑尼特,Tizoxanide）。给药96 h后,在山羊粪便中仍能检测到替唑尼特。在上述方法的基础上,建立了一种用于山羊血浆及尿液中硝唑尼特代谢物鉴定的快速,敏感与特异的液相色谱–串联质谱方法。纯化的样品使用XTerra MS C8柱进行分离,流动相为乙腈与10 mM乙酸铵（pH 2.5）,采用梯度洗脱的方式,样品检测使用MS–MS。代谢物鉴定以及结构解析通过比较原药或其它可用标准的保留时间（retention times, Rt）,全扫描,子离子扫描,母离子扫描与中性丢失扫描的MS–MS质谱图来完成。山羊按200 mg/kg的剂量经口给予硝唑尼特后,在其血浆及尿液中发现并鉴定了四种代谢[替唑尼特（tizoxanide）,替唑尼特葡萄糖醛酸化物（tizoxanide glucuronide）,替唑尼特硫酸酯化物（tizoxanide sulfate）以及羟基替唑尼特硫酸酯化物（hydroxylated tizoxanide sulfate）]。此外,我们首次提出了硝唑尼特在山羊体内可能的代谢途径。研究结果提示,建立的该方法简单,可靠及敏感,证明适合于硝唑尼特活性代谢物的检测及其结构鉴定,从而有助于更好地理解硝唑尼特的体内代谢。建立山羊血浆中测定硝唑尼活性代谢物替唑尼特的简单且特异的HPLC–UV方法。血浆样品用乙腈去蛋白提取,选用Diamonsil C18 （250 mm×4.6 mm, 5μm）为反相色谱柱,乙腈–0.02 mol/l KH2PO4（65:35, v/v）为流动相,流速1.0 ml/min,检测波长360 nm。替唑尼特线性范围为0.2–10μg/ml,检测限为0.02μg/ml （S/N>3）,定量限为0.04μg/ml （S/N>6）。样品平均回收率在94.5%以上,日内、日间精密度的RSD均小于10%,准确率的相对误差在1.42到9.05%之间。其它物质干扰替唑尼特的检测。确证方法成功应用于山羊经口给予硝唑尼特后,其血浆中替唑尼特的药物动力学研究。研究了硝唑尼特活性代谢物替唑尼特在山羊体内的药物代谢物动力学及其在山羊血浆、白蛋白（albumin）与α-1-酸-糖蛋白（α-1-acid-glycoprotein）溶液中的结合能力。使用HPLC–UV方法分析血浆及蛋白质结合样品,检测波长为360 nm,,采用3P97药物动力学程序软件处理药-时数据。山羊血浆中替唑尼特的浓度可以检测到24 h。按200 mg/kg的剂量经口给予山羊硝唑尼特胶囊后,其血浆中替唑尼特浓度–时间数据符合符合一室开放模型（one-compartment open model）,并且存在一级吸收（first order absorption）。主要药动学参数分别为:t1/2Ka 2.51±0.41 h, t1/2Ke 3.47±0.32 h, Tmax 4.90±0.13 h, Cmax 2.56±0.25μg/ ml, AUC 27.40±1.54 （μg/ml）×h, V/F（c） 30.17±2.17 l/kg和CL（s） 7.34±1.21 l/（kg×h）。血浆样品β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase）酶解后,t1/2ke, Cmax, Tmax, AUC增加,而V/F（c）与CL（s）却减小。体外蛋白质结合能力研究结果表明,4μg/ml的替唑尼特在山羊血浆与白蛋白（albumin）溶液中的结合率可达95%以上,而在α-1-酸-糖蛋白溶液中的结合率仅为49%。这一结果表明,替唑尼特以其酸性特征,同α-1-酸-糖蛋白相比,可能与白蛋白具有较强的结合能力。最后,进行了硝唑尼特体内外毒理学以及潜在作用机制的研究。按照200 mg/kg的剂量给口给予山羊硝唑尼特。通过11项尿常规分析与心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,膀胱及胆囊的组织学检查评价了硝唑尼特的系统毒性。结果证实,硝唑尼特无毒,尿常规分析的11项指标正常,而且无器官组织病变出现。MTT试验证实,低于10μg/ml的硝唑尼特对Chang氏肝细胞与Vero细胞的生长无影响,而对两种细胞的敏感性不同。然而,当浓度为10100μg/ml时,对两种细胞的生长均有量效相关的抑制作用,且对Chang氏肝细胞与Vero细胞的IC50分别为37μg/ml与41μg/ml。同空白细胞对照相比,药物处理特别是较高剂量的硝唑尼特作用可以使293T细胞数量减少,皱缩明显,凋亡增多。用Western blot进一步分析,结果发现,硝唑尼特可以促进p53表达,且作用剂量为10μg/ml时不影响细胞周期。总之,硝唑尼特具有良好的耐受性,而且能促进p53表达,从而导致细胞凋亡。

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摘要

ABSTRACT

缩略词

第一章前言

第二章文献综述

2.1 硝唑尼特

2.1.1 前言

2.1.2 物理化学性质

2.1.3 药效学属性

2.1.4 耐药性

2.1.5 代谢动力学属性

2.1.6 耐受性

2.1.7 临床应用

2.1.8 非临床应用

2.1.9 总结

2.2 药物代谢动力学原理、研究技术及应用

2.2.1 前言

2.2.2 药物在体内的过程

2.2.3 药物代谢与药物动力学房室模型

2.2.4 药物代谢与药物动力基本学参数

2.2.5 药物代谢与药物动力学研究技术与方法

2.2.6 药物代谢与药物动力学研究试验设计

2.3 液相色谱-质谱联用技术在药物代谢研究中的应用

2.3.1 前言

2.3.2 LC–MS 仪器简介与工作原理

2.3.3 LC–MS 的基本功能

2.3.4 LC–MS 的实验技术

2.3.5 LC–MS 方法的优点和局限性

2.3.6 LC–MS 在药物代谢研究中的应用

2.3.7 结论

第三章硝唑尼特在山羊粪便中的代谢谱系研究

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 试剂与药品

3.2.2 标准品及流动相制备

3.2.3 实验动物与给药

3.2.4 样品制备

3.2.5 LC–MS–MS 仪器及运行条件

3.2.6 LC–MS–MS 条件优化

3.3 结果与讨论

3.3.1 LC–MS–MS 条件优化

3.3.2 山羊给药前后的大体观察

3.3.3 硝唑尼特与替唑尼特LC–MS 及 LC–MS–MS 分析

3.3.4 粪便代谢物LC–MS 及LC–MS–MS 分析

3.4 结论

第四章液相色谱–串联质谱分析山羊体内的硝唑尼特及其主要代谢物

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 标准品与受试药物

4.2.2 试剂与材料

4.2.3 仪器设备

4.2.4 溶液制备

4.2.5 实验动物与给药

4.2.6 血浆及尿液样品收集

4.2.7 血浆样品制备

4.2.8 尿样品制备

4.2.9 色谱条件

4.2.10 质谱条件

4.3 结果与讨论

4.3.1 大体观察

4.3.2 代谢物LC–MS 及 LC–MS–MS 分析

4.3.3 硝唑尼特在山羊体内的代谢谱系

4.4 结论

第五章山羊血浆中替唑尼特HPLC–UV检测方法的建立、确证及应用

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料与试剂

5.2.2 仪器设备

5.2.3 标准品制备

5.2.4 溶液制备

5.2.5 实验动物与给药

5.2.6 血浆样品采集

5.2.7 血浆样品制备

5.2.8 色谱条件

5.2.9 方法确证

5.2.10 药物动力学研究

5.3 结果与讨论

5.3.1 方法建立及优化

5.3.2 方法确证

5.3.3 药物动力学应用

5.4 结论

第六章硝唑尼特活性代谢物替唑尼特在山羊体内的药物代谢物动力学及其体外蛋白结合能力研究

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 材料与试剂

6.2.2 仪器设备

6.2.3 标准品制备

6.2.4 溶液制备

6.2.5 血浆药物动力学

6.2.6 替唑尼特体外蛋白质结合能力

6.2.7 HPLC–UV 分析

6.2.8 数据分析及统计学比较

6.3 结果

6.3.1 定义

6.3.2 大体观察

6.3.3 替唑尼特在山羊体内的药物动力学

6.3.4 替唑尼特体外蛋白质结合率

6.4 讨论

第七章硝唑尼特体内外毒理学研究

7.1 前言

7.2 材料与方法

7.2.1 材料与药品

7.2.2 溶液制备

7.2.3 仪器设备

7.2.4 尿常规检查

7.2.5 组织学检查

7.2.6 MTT 试验

7.2.7 细胞形态观察

7.2.8 蛋白质印迹

7.2.9 细胞周期分析

7.3 结果

7.3.1 尿常规检查

7.3.2 组织学检查

7.3.3 细胞毒性试验

7.3.4 细胞形态观察

7.3.5 细胞凋亡分析

7.3.6 细胞周期分析

7.4 讨论

结论

参考文献

附录

致谢

作者简历

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