CD4+CD25+调节性T细胞对B淋巴细胞作用机制分析

论文摘要

CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+regulatory T cell，CD4+CD25+TReg，简写为TReg），占正常个体外周CD4+T淋巴细胞的5％-10％。1969年Nishizaka等在切除新生小鼠胸腺的实验中发现机体内存在一类抑制性T细胞（suppressor T cell）。这类细胞可以调节自身反应性T细胞。后来发现，这些细胞表面表达CD25（IL2受体的α链），因此常用CD4+CD25+T细胞表示，由于TReg具有免疫抑制活性，所以最初称为抑制性T细胞，现在则称为调节性T细胞。在Treg的免疫抑制方面，近年来已经有实验证实了Treg对效应性T细胞的抑制作用机制。但是Treg细胞介导效应性B细胞功能抑制，尤其是介导移植耐受的相关免疫学机制仍处在不断的探索和发现之中。因此本研究将对Treg细胞与B细胞的作用机制进行探索和分析。第一部分CD4+CD25+Treg细胞体外分选和富集目的：建立CD4+CD25+调节性T细胞（Regulatory T Cells，Treg）的磁珠（MACS）分选方法，并对分选结果进行纯度鉴定。方法：首先分离大鼠脾脏淋巴细胞悬液。采用Meltiny MACS分选方法结合磁板分选系统进行分选。用以CD4+T cell Biotin-Antibody和Antibody-Biotin MicroBeads相结合的阳性选择法剔除CD8+T细胞；分选出CD4+T细胞，再以CD25 MicroBeads阳性选择法选出CD25+T淋巴细胞。以胎盘蓝检测分选细胞活性和以FACS流式细胞法检测分选的CD4+CD25+调节性T细胞纯度。最后以RT-PCR检测分选前后细胞中Foxp3表达水平。结果：MACS磁珠双阳性分选法能够成功分选出CD4+CD25+调节性T细胞，分选平均纯度达到79．2%±2．8%，分选细胞活力为91．3％±3．4％。分选的CD4+CD25+调节性T细胞内有明确的Foxp3表达，脾脏淋巴细胞表达弱阳性，而CD4CD25-T细胞表达阴性。结论：MACS磁珠双阳性分选法能够分选出高纯度的CD4+CD25+Treg细胞，该分选方法不影响分选靶细胞的细胞活力。能保证体外培养和细胞输注等一系列后序实验的进行。第二部分Treg细胞诱导慢性排斥反应中对B淋巴细胞的作用目的：研究Treg细胞对对同种MLR的抑制量效分析；通过设置Treg细胞与效应性B细胞共培养和分隔培养实验模型，并通过阻断相应细胞因子，以及设置Treg细胞与Th细胞的共培养实验模型，分析Treg细胞对效应性B细胞形成抑制作用的可能机制及各机制的主次要关系。方法：在混合淋巴细胞反应体系中添加不同数量的Treg细胞，以MTT法检测各组OD值并计算抑制率。应用尼龙毛柱法分离B细胞，以胎盘蓝检测分选细胞活性和以FACS流式细胞法检测分选B细胞的纯度。然后将分离纯化的Wistar大鼠Treg细胞负载SD大鼠抗原，并以MTT法检测供体抗原负载情况。继而以Trans WellMillcell-PCF分隔培养槽分隔或共培养Treg细胞与B淋巴细胞组成的反应体系，在共培养体系中加入或不加入Anti-TGF-β1、Anti-CTLA4的阻断方法。培养5天，后用IMMAGE800（双光径免疫浊度分析仪）发检测不同组上清中的IgA和IgG分泌水平。将不同数量Treg细胞与Th细胞组成共培养实验模型，运用MTT法检测各组各组OD值并计算抑制率。结果：5×104的Treg细胞即能对同种混合淋巴细胞反应形成明显抑制（抑制率76．1％，VS阳性对照组P<0．01），随着Treg细胞数量的增高，抑制效率也同时增加。当Treg细胞数量>105时，抑制效率基本维持恒定（Treg细胞数量>104的各组之间P>0．05）。经过SD大鼠肝脏抗原特异诱导后，分选的Wistar大鼠CD4+CD25+Treg细胞具备了对SD大鼠抗原特异性。Wistar大鼠脾脏单个核细胞经尼龙毛柱法分选B细胞分离纯度为80．4％±4．2％（71％-84％，n=4），细胞存活率92．5％±4．4％。分隔培养组上清中的IgG和IgA水平分别为（4．7±1．1）μg／ml、（10．5±1．7）μg/ml，与阳性对照组中IgG的含量（5．1±1．0）μg/ml以及IgA的（11．2±1．6）μg／ml相比没有显著差异（P>0．05），而与阳性对照组相比较，共培养组上清中的IgG和IgA水平明显降低（P<0．01）。分别达到了（2．2±0．8）μg／ml和（5．4±0．9）μg／ml。在共培养体系中加入Anti-TGF-β1后上清中的IgG和IgA的分泌水平分别达到（3．1±0．5）μg／ml和（6．9±0．8）μg／ml。当加入Anti-CTLA4后上清中的IgG和IgA的分泌水平分别达到（3．2±0．6）μg／ml和（7．2±0．9）μg／ml。两种阻断剂同时加入时，上清中的IgG和IgA的分泌水平分别达到（3．5±0．5）μg/ml和（7．4±0．6）μg／ml。实验中发现三组分泌水平都较共培养组明显升高（P<0．05），不过仍明显低于阳性对照组的水平（P<0．05）。Treg与Th共培养体系中各组抑制率SR分别为：SR阴性对照组=0、SR阳性对照组=100％、SR组Ⅰ=36．6％、SR组Ⅱ=55．3％、SR组Ⅲ=74．6％。与阳性对照组相比较，SR组Ⅰ、SR组Ⅰ、SR组Ⅰ经统计学处理有显著差别（P<0．05）。结论：Treg细胞对同种混合淋巴细胞反应的抑制呈现明显的剂量效应关系，其对同种混合淋巴细胞反应的抑制有明显的剂量饱和特性。经过SD大鼠肝脏抗原特异诱导后，分选的Wistar大鼠CD4+CD25+Treg细胞具备了对SD大鼠抗原特异性。采用尼龙毛柱法分选B淋巴细胞，纯度和得率可以满足实验要求。CD4+CD25+Treg对效应性B细胞的抑制作用主要是通过细胞间直接接触机制发生作用。CD4+CD25+Treg细胞对B细胞的直接接触抑制作用中细胞因子TGF-β1和CTLA4发挥了部分作用。Treg细胞也可通过抑制Th细胞，从而间接抑制B淋巴细胞介导的体液反应。

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• 前言
• +CD25⁺Treg细胞体外分选和富集'>第一部分 CD4⁺CD25⁺Treg细胞体外分选和富集
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 Treg细胞诱导慢性排斥反应中对B淋巴细胞的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文总结
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