永生化人肝细胞和转人端粒酶基因脐带间充质干细胞分化的研究

论文摘要

生物型人工肝（bioartificial liver,BAL）治疗需要合适的种子细胞,正常人肝细胞是BAL较为理想的细胞源。然而肝细胞属于终末分化细胞,体外生存期短、来源受限,因此在应用方面受到限制。永生化肝细胞具有增殖优势、高分化功能及培养费用低等特点,有着广阔的应用前景。然而,即使在最佳的培养条件下,单一细胞系也不能完成肝细胞所有的功能。新近报道人脐带间充质干细胞（humanumbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）具有多向分化的潜能,且容易获得、取材方便,无伦理方面争议,极可能诱导分化成肝细胞,因此,hUCMSCs可能是BAL一种新的细胞来源。然而MSCs与机体其它正常体细胞一样,也存在Hayflick界限,即在经过有限次的细胞传代后,就会停止增殖,且发生衰老和死亡。人端粒酶是一种由RNA和蛋白质两种组份构成的核糖核蛋白复合体,其中RNA组份是端粒酶复制时的模板,蛋白质组分主要是具有反转录酶活性的端粒酶催化亚基（human telomerase reverse transcriptase subunit,hTERT）,其功能是利用自身RNA为模板,催化合成端粒DNA并加到染色体末端,使端粒延长。端粒的长度和细胞分裂时端粒损失的速度决定了细胞的衰老和寿命,通过诱导端粒酶的产生,端粒的长度可以得到修复和保持,使细胞的生命延长甚至永生。本研究拟通过人端粒酶逆转录酶催化亚基（hTERT）慢病毒表达载体构建hTERT-L02肝细胞和hTERT-hUCMSCs两种细胞,并对它们的生物学特性及功能特征进行研究,探讨利用新的肝细胞来源应用于BAL的价值,为共培养体系提供细胞学基础,同时探究体外分离小块肝组织培养正常成人肝细胞的方法,为研究成人原代肝细胞的永生化提供细胞学基础。本文主要分为两大部分:（1）利用慢病毒载体将人端粒酶逆转录酶催化亚基（hTERT）转染人肝细胞并对其生物学特性及功能特征进行研究,同时探讨体外分离小块肝组织培养正常成人肝细胞的方法;（2）构建转hTERT脐带间充质干细胞,并对其增殖及肝细胞方向分化能力进行检测,同时初步评估其应用安全性。第一部分利用基因重组、定点突变及Gateway等技术制备了表达hTERT基因的重组慢病毒,将其转染人肝细胞L02,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆细胞,分别采用实时荧光RT-PCR,TRAPeze（?） ELISA方法检测转染前后L02肝细胞的hTERT-mRNA水平和端粒酶活性的变化,在此基础上,通过MTT法、流式细胞法及RT-PCR等方法观察其形态和生物学功能的变化,结果显示该细胞在体外培养条件下基本维持肝细胞原有形态,存活期显著延长,增殖能力较强,在生物学功能方面,转染肝细胞同样具有表达和分泌ALB、LDH、ALT、AST及糖原合成的功能且未检测到AFP的表达。成功构建的hTERT-L02肝细胞有望解决人肝细胞来源稀少的难题。与此同时,建立体外分离小块肝组织,培养成人肝细胞的实验体系,采用胶原酶联合分散酶法分离的肝细胞具有操作简单、价格低廉的特点,同时获得的肝细胞量相对较多且存活率较高,为初步研究成人原代肝细胞的永生化提供了细胞学基础。第二部分使用胶原酶消化法分离脐带中的MSCs,进一步培养并鉴定,采用含hTERT的重组慢病毒感染hUCMSCs,建立过表达端粒酶的hUCMSCs,通过光镜、原子力显微镜、MTT等方法观察该细胞基本生物学特性,探讨其向肝系细胞分化的可能性。结果显示转染后的hUCMSCs基本维持MSCs原有形态,存活期显著延长,增殖能力较强,在体外具有原代MSCs相同的向脂肪细胞,成骨细胞分化潜能,且无裸鼠致瘤性,加入细胞因子可成功将hTERT-hUCMSCs向肝样细胞诱导分化,分化的细胞可表达肝细胞表面标志物ALB、AFP、CK18。构建的hTERT-hUCMSCs细胞具有向肝细胞分化的潜能,可能成为BAL和肝细胞移植的新的种子细胞,并且为共培养体系提供了细胞学基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一章 永生化人肝细胞的研究
• 第一节 慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT的构建及鉴定
• 1.1 前言
• 1.2 实验材料及方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 参考文献
• 第二节 hTERT重组慢病毒颗粒的获得及滴度测定
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料及方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 参考文献
• 第三节 转人端粒酶基因L02肝细胞的构建及其生物学特性研究
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料及方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 参考文献
• 第四节 成人肝细胞的分离培养
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料及方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 参考文献
• 第二章 转hTERT脐带间充质干细胞分化的研究
• 第一节 脐带间充质干细胞的分离培养及鉴定
• 1.1 前言
• 1.2 材料与方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 参考文献
• 第二节 转hTERT脐带间充质干细胞的构建及其分化为肝样细胞的研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料及方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 参考文献
• 全文结论
• 附录
• 在校期间发表的论文
• 致谢