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胰岛素瘤发病危险因素调查及mTOR/PRAS40/P70S6K信号通路在其发病中作用机制研究

2020-12-11阅读(752)

胰岛素瘤发病危险因素调查及mTOR/PRAS40/P70S6K信号通路在其发病中作用机制研究

论文摘要

研究背景胰岛素瘤是最常见的胰腺内分泌肿瘤,占功能性胰腺内分泌肿瘤的70-80%,但由于其年发病率仅为4/百万,病例资源的稀缺导致临床医师对其临床特点及生物学行为认识不够透彻,并且也大大限制了对其发病机制的基础研究,国内外尚无关于其发病危险因素的大样本量流行病学调查,其发病、演进及转移机制目前仍不明了。近年研究发现哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR参与多种肿瘤的发生及进展,并且PRAS40在其中发挥重要的调节作用,mTOR/PRAS40/P70S6K信号转导通路是否参与胰岛素瘤的发病,PRAS40表达水平是否对mTOR活性及胰岛素瘤增殖产生影响,目前仍不明了。目的（1）探索胰岛素瘤发病危险因素及高危人群；（2）了解mTOR/P70S6K通路在胰岛素瘤组织中活化、表达情况；（3）观察mTOR及PI3K/mTOR双重抑制剂对mTOR通路活性及对胰岛素瘤细胞增殖、胰岛素分泌功能及凋亡的影响；（4）探讨PRAS40表达水平对mTOR氵舌性及胰岛素瘤细胞增殖的影响。方法（1）对北京协和医院基本外科2000年1月至2010年1月期间收治的196例胰岛素瘤患者病历资料进行回顾性分析,并以同期收治的233例非肿瘤患者作为对照,进行以医院为基础的病例-对照研究,采用单因素及多因素分析方法评价环境因素、生活方式、家族史等相关危险因素是否与胰岛素瘤发病存在关联及联系程度大小；（2）采用RT-PCR法观察mTOR及P70S6K mRNA在胰岛素瘤及正常胰腺组织的表达情况,另外用免疫组织化学及Western blottting方法,观察p-mTOR及p-P70S6K在胰岛素瘤组织及正常胰腺组织中的表达差异；（3）分别使用mTOR抑制剂（雷帕霉素）及PI3K/mTOR双重抑制剂（NVP-BEZ235）干预胰岛素瘤INS-1细胞,RT-PCR及Western blotting观察抑制剂对该通路关键基因及蛋白表达影响,并采用MTT、流式细胞仪检测增殖及凋亡、葡萄糖刺激胰岛素分泌实验（GSIS）等方法评价两种抑制剂对胰岛素瘤细胞增殖、胰岛素分泌功能及凋亡等影响；（4）使用PRAS40-siRNA瞬时转染INS-1细胞,Taqman Real time PCR法了解PRAS40沉默效果,Western blotting观察其对nTOR及P70S6K磷酸化水平的影响,MTT比色法观察下调PRAS40表达对INS-1细胞增殖的影响。结果（1）农村人口（OR=4.950,P<0.0001）、胰腺内分泌肿瘤家族史（OR=16.754,P=0.007）、其他恶性肿瘤家族史（OR=2.360,P=0.037）为胰岛素瘤发病的独立危险因素,吸烟及饮酒是否为胰岛素瘤发病危险因素需进一步研究验证；（2）免疫组化及Western blotting纟吉果提示p-mTOR及p-P70S6K在胰岛素瘤组织中的表达水平明显高于正常胰腺（胰岛）组织,胰岛素瘤组织nTOR及P70S6K mRNA水平亦高于正常胰腺组织；（3）雷帕霉素及NVP-BEZ235可抑制mTOR及其下游P70S6K表达活化,继而导致细胞G1期阻滞,抑制胰岛素瘤细胞INS-1增殖,降低INS-1细胞分泌胰岛素及对葡萄糖刺激反应能力,同时可促进凋亡,但高浓度雷帕霉素可引起mTORC1的负反馈调节,导致p-mTOR表达水平的升高,NVP-BEZ235抑制PI3K/mTOR/P70S6K通路活性的能力更强,其抑制细胞增殖及促凋亡能力优于雷帕霉素；（4）使用脂质体将PRAS40-siRNA瞬时转染INS-1细胞,转染效果理想,转染沉默PRAS40表达后可促进mTOR活性,mTOR及其下游P70S6K蛋白磷酸化水平增高,继而促进INS-1细胞增殖。结论（1）农村人口、胰腺内分泌肿瘤家族史及其他恶性肿瘤家族史为胰岛素瘤发病的独立危险因素；（2） mTOR/P70S6K通路在胰岛素瘤中异常激活,可能参与胰岛素瘤的发生发展；（3） NVP-BEZ235可有效抑制：mTOR/P70S6K通路活性,为恶性胰岛素瘤的治疗及进一步研究提供依据及理论基础;（4）在胰岛素瘤细胞中PRAS40负向调节mTOR功能,靶向干预PRAS40表达可能会为胰岛素瘤及其他肿瘤治疗提供新思路及靶点。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 缩略词表
  • 1 前言
  • 1.1 胰岛素瘤临床特点及诊断治疗
  • 1.1.1 概述
  • 1.1.2 诊断
  • 1.1.3 治疗
  • 1.2 胰岛素瘤发病机制研究现状
  • 1.2.1 发病危险因素及高危人群
  • 1.2.2 发病相关基因及信号转导通路
  • 2 第一部分:中国人群胰岛素瘤发病危险因素调查
  • 2.1 实验设计及方法
  • 2.1.1 研究对象
  • 2.1.2 研究方法
  • 2.1.3 危险因素定义
  • 2.1.4 样本量计算
  • 2.1.5 统计学分析
  • 2.2 结果
  • 2.2.1 胰岛素瘤流行病学资料
  • 2.2.2 胰岛素瘤发病危险因素病例-对照研究
  • 2.3 讨论
  • 2.4 本部分研究小结
  • 3 第二部分:人胰岛素瘤组织中mTOR/P70S6K信号通路表达情况研究
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 主要仪器
  • 3.1.2 主要试剂
  • 3.1.3 主要试剂及缓冲液配制
  • 3.1.4 实验方法
  • 3.2 结果
  • 3.2.1 患者临床资料
  • 3.2.2 人胰岛素瘤p-mTOR及p-P70S6K免疫组化结果
  • 3.2.3 人胰岛素瘤mTOR及P70S6KmRNA表达情况
  • 3.2.4 Western blotting结果
  • 3.3 讨论
  • 3.4 本部分研究小结
  • 4 第三部分:mTOR通路抑制剂对mTOR/P70S6K通路活性影响及及对胰岛素瘤细胞增殖、凋亡作用的研究
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 细胞
  • 4.1.2 主要仪器
  • 4.1.3 主要试剂
  • 4.1.4 干预药物及主要缓冲液配制
  • 4.1.5 实验方法
  • 4.2 结果
  • 4.2.1 NVP-BEZ235及雷帕霉素干预后INS-1细胞形态变化
  • 4.2.2 MTT结果
  • 4.2.3 NVP-BEZ235及雷帕霉素对胰岛素瘤细胞细胞周期影响
  • 4.2.4 NVP-BEZ235及雷帕霍素对脯岛素瘤细响凋亡影响
  • 4.2.5 GSIS结果
  • 4.2.6 RT-PCR结果
  • 4.2.7 Western blotting结果
  • 4.3 讨论
  • 4.4 本部分研究小结
  • 5 第四部分:PRAS40调节mTOR活性及对胰岛素瘤细胞增殖影响机制初步研究
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 细胞
  • 5.1.2 主要仪器
  • 5.1.3 主要试剂
  • 5.1.4 实验方法
  • 5.2 结果
  • 5.2.1 荧光显微镜观察转染效率
  • 5.2.2 Real-time PCR 评估 PRAS40 沉默效果
  • 5.2.3 Western blotting 检测 mToR 通路蛋白表达情况
  • 5.2.4 MTT检测PRAS40-siRNA作用后对INS-1细胞增殖影响
  • 5.3 讨论
  • 5.4 本部分小结
  • 6 结论与展望
  • 参考文献
  • 攻读学位期间取得的研究成果
  • 综述
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

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