冬虫夏草菌抗肿瘤活性及其作用机理的研究

论文题目: 冬虫夏草菌抗肿瘤活性及其作用机理的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化工

作者: 张巧霞

导师: 胡宗定,吴建勇

关键词: 冬虫夏草,真菌菌丝体,抗肿瘤作用,细胞凋亡,家族,细胞周期,期阻滞

文献来源: 天津大学

发表年度: 2005

论文摘要: 冬虫夏草（Cordyceps sinensis）,又名虫草,是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合物,具有极高的医疗保健作用和经济价值,是世界上目前最稀有珍贵的药用真菌之一。对于其抗肿瘤作用已经有一些报道,但只是针对虫草的某一部分,如水提物或醇提物等,没有比较全面的研究,对抗肿瘤活性作用机理的研究也不多。考虑到冬虫夏草自然资源极其有限,本文首先进行了虫草菌无性型的分离纯化,并在实验室进行小规模液体发酵培养。然后对分离出的虫草菌HK-1的抗肿瘤活性及其作用机制进行了全面深入的研究,结果表明虫草菌HK-1乙酸乙酯提取物具有显著的抗肿瘤作用。目前临床上使用的许多抗癌药可在不同类型的敏感肿瘤细胞中诱导凋亡,是许多化疗药物抑制肿瘤生长的机制之一。因此,针对虫草菌HK-1诱导细胞凋亡的作用进行了更加深入的研究,结果表明虫草菌HK-1乙酸乙酯提取物可以诱导HL-60细胞凋亡,并且caspase-3参与了凋亡的过程。在哺乳动物细胞凋亡过程中,线粒体被认为处于凋亡调控的中心位置,其关键性分子是细胞色素c （Cyt c）。Bcl-2家族成员在细胞凋亡的线粒体途径中起重要调控作用。因此,我们通过一系列的实验检测了虫草菌HK-1乙酸乙酯提取物诱导HL-60细胞凋亡的过程是否与线粒体有关以及Bcl-2家族主要成员Bcl-2和Bax的变化。结果表明虫草菌HK-1乙酸乙酯提取物诱导的细胞凋亡与线粒体介导的信号传导系统有关,并有Bcl-2家族成员的参与。为了更全面了解虫草菌HK-1乙酸乙酯提取物对肿瘤细胞的影响,用流式细胞仪检测了细胞周期的变化,结果表明可以诱导G2/M期阻滞及G2/M期相关蛋白p34cdc2含量下降。本研究发现虫草菌HK-1乙酸乙酯提取物具有显著的抗肿瘤作用,对其作用机制的进一步研究表明可以诱发由线粒体介导的细胞凋亡,并且使细胞周期发生G2/M期阻滞。这一结果为虫草菌的开发利用及抗肿瘤药物的研究提供了依据,也为细胞凋亡途径的阐明提供了线索。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

前言

第一章 文献综述

1.1 冬虫夏草

1.1.1 冬虫夏草概述

1.1.2 冬虫夏草主要化学成分

1.1.2.1 虫草多糖

1.1.2.2 核苷类化合物

1.1.2.3 蛋白质和氨基酸

1.1.2.4 糖醇和甾醇类

1.1.2.5 其它化合物

1.1.3 冬虫夏草的药理学研究

1.1.3.1 抗肿瘤作用

1.1.3.2 对免疫系统的作用

1.1.3.3 对类固醇合成的刺激作用

1.1.3.4 对机体的代谢调节活性

1.1.3.5 抗氧化作用

1.1.3.6 其它药理作用

1.1.4 冬虫夏草人工培育现状

1.2 天然抗肿瘤药物

1.2.1 肿瘤的危害及抗肿瘤药物的重要性

1.2.2 天然抗肿瘤药物及其作用机制研究进展

1.2.2.1 生物碱

1.2.2.2 萜类

1.2.2.3 黄酮类

1.2.2.4 多糖

1.3 细胞凋亡

1.3.1 细胞凋亡概述

1.3.2 细胞凋亡的形态特征

1.3.2.1 细胞核的变化

1.3.2.2 细胞质的变化

1.3.2.3 凋亡小体的形成

1.3.3 细胞凋亡的生化特征

1.3.3.1 DNA 片段化

1.3.3.2 胞浆Ca~(2+)的升高与分布变化

1.3.3.3 胞浆pH 的变化

1.3.4 细胞凋亡的信号传导途径

1.3.4.1 死亡受体介导的信号传导途径

1.3.4.2 线粒体依赖的信号传导途径

1.3.4.2.1 电子传递和能量代谢的瓦解

1.3.4.2.2 线粒体跨膜电位(ΔΨm)与MPT 孔道

1.3.4.2.3 Cyt c、Apaf-1 及procaspase-9 复合体

1.3.5 细胞凋亡的中枢效应器——Caspase 蛋白酶家族

1.3.5.1 Caspase 家族成员结构和分类

1.3.5.2 Caspase 的激活

1.3.5.3 Caspase的生理功能

1.3.6 Bcl-2 基因家族

1.3.6.1 Bcl-2 的发现

1.3.6.2 Bcl-2 基因及其蛋白的分子结构

1.4 细胞凋亡在肿瘤的发生、发展及治疗中的作用

1.4.1 细胞凋亡与肿瘤的发生、发展

1.4.2 细胞凋亡与肿瘤治疗

1.4.2.1 化疗

1.4.2.2 放疗

1.4.2.3 生物治疗

1.5 本论文研究的内容

第二章 虫草菌的分离培养及其主要成分分析

2.1 实验材料和方法

2.1.1 仪器

2.1.2 试剂

2.1.3 天然冬虫夏草的来源

2.1.4 虫草菌HK-1 的分离

2.1.5 菌丝体的液体培养

2.1.6 总的糖含量的测定

2.1.7 总蛋白含量的测定

2.1.8 腺苷和虫草素含量的测定

2.2 实验结果

2.2.1 虫草菌HK-1 的形态学特征

2.2.2 虫草菌主要化学成分的测定及其与天然冬虫夏草的比较

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 人工虫草菌 HK-1与天然虫草抗肿瘤活性比较

3.1 实验材料和方法

3.1.1 仪器

3.1.2 试剂

3.1.3 虫草菌HK-1 和天然虫草提取物的制备

3.1.4 肿瘤细胞培养

3.1.4.1 复苏

3.1.4.2 传代

3.1.4.3 保存

3.1.5 MTT 比色法

3.1.6 麦角甾醇、腺苷和环孢霉素A 含量测定

3.2 实验结果

3.2.1 提取物对816 细胞的生长抑制作用

3.2.2 乙酸乙酯提取物对其它肿瘤细胞的生长抑制作用

3.2.3 虫草菌HK-1 与天然虫草主要活性成分含量的比较

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 虫草菌 HK-1的抗肿瘤活性

4.1 实验材料和方法

4.1.1 仪器

4.1.2 试剂

4.1.3 正常小鼠骨髓细胞的分离培养

4.1.4 动物模型的建立

4.1.5 抗肿瘤治疗实验方案

4.1.6 疗效观察方法

4.2 实验结果

4.2.1 出膏率和主要成分含量

4.2.2 虫草菌HK-1 对体外培养的肿瘤细胞的生长抑制作用

4.2.3 虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物对正常细胞的抑制作用

4.2.4 虫草菌HK-1 在体内对小鼠黑色素瘤816 的抑制作用

4.2.5 虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物中抗肿瘤活性成分

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 中草菌 HK-1对肿瘤细胞的凋亡诱导作用

5.1 实验材料和方法

5.1.1 仪器

5.1.2 试剂

5.1.3 Hoechst 33258 染色

5.1.4 DNA ladder

5.1.4.1 凋亡细胞DNA 的提取

5.1.4.2 琼脂糖凝胶电泳

5.1.5 Caspase-3 活性测定

5.1.6 Western blotting

5.1.6.1 样品制备

5.1.6.2 PAGE-SDS 凝胶电泳

5.1.6.3 电转移

5.1.6.4 Western blotting

5.2 实验结果

5.2.1 虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物作用后HL-60 细胞形态变化

5.2.2 虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物诱导HL-60 细胞染色质凝集

5.2.3 虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物诱导细胞核DNA片段化

5.2.4 虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物诱导Caspase-3 活性

5.2.5 虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物诱导PARP 蛋白水解

5.3 讨论

5.4 小结

第六章 虫草菌 HK-1诱导肿瘤细胞凋亡的信号传导途径

6.1 实验材料和方法

6.1.1 仪器

6.1.2 试剂

6.1.3 细胞荧光染色(Hoechst 33258 和CMXRos)

6.1.4 线粒体与细胞质的分离

6.1.5 Caspase 活性测定

6.2 实验结果

6.2.1 低浓度虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物诱导细胞核DNA片断化

6.2.2 虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物诱导线粒体膜电位(Δψm)下降

6.2.3 虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物诱导线粒体内Cyt c的转移

6.2.4 虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物诱导Bcl-2 和Bax蛋白的变化

6.2.5 虫草菌HK-1乙酸乙酯提取物诱导Caspase 酶活性

6.3 讨论

6.4 小结

第七章 虫草菌 HK-1对肿瘤细胞 HL-60细胞周期的影响

7.1 实验材料和方法

7.1.1 仪器

7.1.2 试剂

7.1.3 流式细胞仪分析细胞周期

7.2 实验结果

7.2.1 虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物对HL-60 细胞周期时相的影响

7.2.2 虫草菌HK-1 乙酸乙酯提取物对p21~(WAF1/CIP1)、CyclinB1和p34~(cdc2)蛋白含量的影响

7.3 讨论

7.4 小结

第八章 总结与设想

8.1 总结

8.2 设想

参考文献

作者在攻读博士学位期间发表的论文

致谢

发布时间: 2007-07-10

参考文献

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