论文题目: 一个侵染浙贝母的马铃薯Y病毒属新成员——浙贝母花叶病毒的鉴定
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 韦传宝
导师: 陈剑平,陈炯
关键词: 马铃薯病毒属,浙贝母花叶病毒,结构基因组学,分子鉴定,分类
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 浙江省宁波市和磐安县栽培的浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq,Thunbergfritillary)植株表现花叶或斑驳症状。用略作修改的常规线状病毒提提方法从病叶中提取出一种线状病毒,经过一系列鉴定,确定为马铃薯Y病毒属的一个新种,暂命名为浙贝母花叶病毒(Thunberg fritillary mosaic virus,TFMV)。 该病毒粒子长约750 nm,直径12-13 nm,略弯曲。病叶细胞质中含有马铃薯Y病毒属成员特异的柱状(风轮状)内含体和长的簿片状聚集体。用SDS-PAGE方法确定该病毒CP的相对分子质量为32 kDa。除浙贝母外,摩擦接种该病毒于17种广泛应用的指示植物均不表现症状。该病毒CP与26种来自5个不同属病毒的CP无血清学关系。Western blot、对流免疫电泳和火箭免疫电泳可以定性检测病叶中的浙贝母花叶病毒,而免疫扩散和ELISA方法不适合该病毒的检测。 分别测定了浙贝母花叶病毒宁波和磐安分离物的基因组全序列。宁波分离物(序列登录号AJ851866)和磐安分离物(序列登录号AJ885005)的基因组均由9723个核苷酸组成(不包括polyA尾),均具有单一开读框。二者全序列高度同源,全序列核苷酸同一性为98.1%,多聚蛋白氨基酸序列同一性为98.0%,可以肯定两个分离物属同一种病毒。计算机分析揭示,二者有相同的基因组结构,开读框均起始于第107-109位的第一个AUG起始密码子,均终止于第9494.9496位UGA终止密码子,均编码一个由3129个氨基酸组成的的多聚蛋白,相对分子质量为354.4 kDa,3’-NTR长224个核苷酸。 TFMV基因组结构具有典型的马铃薯Y病毒属成员的基因组结构特征,它的多聚蛋白裂解位点分别是IKEF/S(P1/HC.Pro)、YRVG/G(HC-Pro/P3)、YIFQ/A(P3/6K 1)、MKFQ/S(6K 1/CI)、LHFQ/S(CI/6K2)、YSFQ/A(6K2/NIa-VPg)、LVFE/S(NIa-VPg/NIa-Pro)、WNFQ/A(NIa-Pro/NIb)和。FCFQ/A(NIb/CP)。推测的CP由269个氨基酸组成,相对分子质量为30.7 kDa,与SDS-PAGE测定的结果相似。 用TFMV基因组全序列与39种其他马铃薯Y病毒属成员的全序列进行同一性比较和系统进化树分析。TFMV与百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)在6K1、VP2和NIb区域最相似,全长多聚蛋白氨基酸序列的BLAST搜索显示LMoV与TFMV关系最近,两者ORF氨基酸序列同一性为53.0%,核苷酸序列同一性为56.7%。全长多聚蛋白氨基酸序列系统进化树分析揭示TFMV与韭葱黄条病毒(Leekyellow stripe virus,LYSV)、LMoV、菜豆黄花叶病毒(Bean yellowmosaic virus,BYMV)和三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus,ClYVV)具有明显的成簇关系,特别与LYSV成簇明显。LYSV和LMoV同样侵染百合科单子叶球茎植物。 将TFMV与82种马铃薯Y病毒属和黑麦草花叶病毒属成员基因组3’-末端编码序列(部分NIb和全长CP基因)进行系统进化树分析。结果表明TFMV与石蒜轻斑驳病毒(Lycors mild mottle virus,LyMMoV,AF399672)关系较近,二者3’-末端序列核苷酸同一性为69.1%,CP基因核苷酸序列同一性为72.8%。
论文目录:
致谢
表格
LIST OF TABLES
图
LIST OF FIGURES
论文所用缩写及中英文对照
摘要
ABSRTRACT
第1章 马铃薯Y病毒科病毒研究综述
1.1 马铃薯Y病毒科的分类
1.1.1 马铃薯Y病毒科的现有分类状况
1.1.2 基因序列分类标准
1.2 马铃薯Y病毒属
1.2.1 普通生物学
1.2.1.1 症状及危害
1.2.1.2 寄主范围
1.2.1.3 介体及其传播
1.2.1.4 病毒粒子特征与细胞病理学
1.2.2 基因组结构与编码蛋白功能
1.2.2.1 非编码区
1.2.2.2 P1蛋白
1.2.2.3 HC-Pro蛋白
1.2.2.4 P3蛋白
1.2.2.5 6K1与6K2蛋白
1.2.2.6 C1蛋向
1.2.2.7 NIa蛋白
1.2.2.8 NIb蛋白
1.2.2.9 CP
1.2.3 马铃薯Y病毒属成员与寄主的互作
1.2.3.1 病毒的系统侵染
1.2.3.2 寄主植物对病毒的抗性
1.2.3.3 寄主显症机理
1.3 大麦黄花叶病毒属
1.3.1 普通生物学
1.3.1.1 症状和危害
1.3.1.2 寄主范围
1.3.1.3 介体及病毒传播
1.3.1.4 病毒粒子形态学与细胞病理学
1.3.2 基因组结构及编码蛋白功能
1.3.3 缺失突变及病毒编码的基因功能
1.4 甘薯病毒属
1.5 柘橙花叶病毒属
1.6 黑麦草花叶病毒属
1.7 小麦花叶病毒属
参考文献
第2章 材料与方法
2.1 试剂与仪器
2.1.1 试剂
2.1.2 仪器
2.2 材料
2.2.1 病样
2.2.2 菌株与载体质粒
2.3 方法
2.3.1 摩擦接种
2.3.2 病毒提纯
2.3.3 电子显微镜观察
2.3.3.1 浸出法
2.3.3.2 免疫吸附电镜
2.3.3.3 常规超薄切片
2.3.4 RNA抽提
2.3.4.1 植物总RNA抽提
2.3.4.2 从提纯的病毒粒子中抽提病毒RNA
2.3.5 逆转录
2.3.6 聚合酶链式反应(PCR)
2.3.7 克隆
2.3.7.1 DNA片段的切胶纯化
2.3.7.2 T-A连接
2.3.7.3 感受态细胞制备(CaCl_2法)
2.3.7.4 转化和筛选
2.3.7.5 质粒提取
2.3.7.6 重组质粒的鉴定
2.3.8 序列测定和分析
2.3.9 外源基因的原核表达
2.3.10 SDS-PAGE
2.3.11 抗血清的制备
2.3.12 Western blot
2.3.13 ELISA检测
2.3.14 抗血清效价测定
2.3.15 火箭免疫电泳
2.3.16 对流免疫电泳
2.3.17 免疫扩散
2.3.18 透析与浓缩技术
2.3.19 无RNase处理技术
参考文献
第3章 浙贝母花叶病毒的普通生物学和血清学
摘要
3.1 症状
3.2 病毒粒子特点
3.2.1 病毒提纯
3.2.2 电镜观察
3.2.3 病毒的紫外吸收
3.2.4 外壳蛋白组分及其分子量
3.3 细胞病理学
3.4 寄主范围
3.5 血清学特性
3.5.1 抗血清制备
3.5.2 与其它病毒的血清学关系
3.6 免疫学检测
3.6.1 免疫扩散
3.6.2 ELISA检测
3.6.3 免疫火箭电泳
3.6.4 对流免疫电泳
参考文献
第4章 浙贝母花叶病毒基因组全序列
摘要
4.1 基因组全序列扩增、克隆和序列测定
4.1.1 3’-RACE
4.1.2 中间病毒序列的简并引物PCR扩增
4.1.3 5’-RACE
4.1.4 RNA基因组cDNA全序列
4.2 基因组结构
4.3 与马铃薯Y病毒属其他成员的序列比较
4.4 系统进化树分析
4.5 分类
4.6 讨论
参考文献
主要结论
博士研究生期间代表性论文
发布时间: 2005-10-10
参考文献
- [1].白草花叶病毒原的分子变异与鉴定[D]. 邓丛良.中国农业大学2004
- [2].小麦黄色花叶病毒RNA1的自然变异分析[D]. 杨军.中国农业大学2003
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