（内蒙古医科大学2015级研究生；内蒙古包头014010）
[摘要]生存素是凋亡抑制蛋白家族成员中分子量最小而抗凋亡作用最强的成员，应用RNA干扰技术可以阻断转录后的基因表达，靶向Survivin-shRNA对肿瘤有多重的抑制作用，使其成为新的靶向治疗的方法。
[关键词]Survivin-shRNA；肿瘤；动物
ResearchprogressoftargetingSurvivin-shRNAintumoranimal
LiuXia,HaoYuqin
InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot,010110,China
Correspondingauthor:HaoYuqin,E-mail:haoyuqin0472@163.com
[Abstract]Survivinapoptosisproteinfamilymembersandmembersoftheminimumamountoftheantiapoptosiseffectofthestrongest,applicationofRNAinterferencecaninhibittheposttranscriptionalgeneexpressiontargetingSurvivin-shRNAhasinhibitoryeffectontumormultiplicity,makeitbecomethenewmethodoftargetedtherapy.
[Keywords]Survivin-shRNA;tumor;animal
肿瘤是一种尚未征服的慢性疾病，其起因非常复杂，除了患者遗传分子的改变之外，还与其生活环境、个人的行为习惯和以及致癌物的接触等有关。肿瘤分子水平上表现为原癌基因的激活（如c-jun、c-fos、Survivin）与抑癌基因的失活（如P53、P14、E-cad）。肿瘤的生成的过程是多因素、多步骤共同造成的。生存素(Survivin)是一种新的凋亡抑制因子，在正常组织很少表达，但在肿瘤组织中高表达。RNA干扰是一种由双链RNA引起的特异性基因沉默的现象。Survivin-shRNA是近年对肿瘤抑制作用的新的靶向治疗方法，对肿瘤的抑制有多种作用。
1.生存素
生存素是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein，IAP)家族新成员。它是分子量最小而抗凋亡作用最强的成员，广泛表达于人的胚胎组织和各种肿瘤组织，也表达于少数正常成人组织[1]，在美国国立癌症研究院的抗癌药物筛选计划使用的60种人肿瘤细胞株中均有表达，如在肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌及淋巴瘤等常见肿瘤[2]。其余的lAPs则能够广泛表达于正常成人组织中，这是Survivin与IAPs家族其他成员的最大区别之一。其具有抑制细胞凋亡和调节细胞的有丝分裂的双重功能，是联系细胞周期和细胞凋亡的重要因子[3]。生存素在肿瘤组织中的特异性表达和功能，使其成为肿瘤研究的潜在靶点。
2.关于RNA干扰
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是近几年发展起来的转录后基因阻断技术。其应用是先确定靶基因的结构，利用双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)进入细胞后特异性降解细胞内同源信使RNA(mRNA)，从而阻断特定基因表达，其作用相当于基因敲除[4]。shRNA是一段具有紧密发卡环的RNA序列，通过载体将克隆其编码的DNA导入细胞，在细胞中，shRNA被加工成小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)，发挥抑制特异mRNA表达的作用，这种装载了shRNA可以稳定的传递到子代细胞中去[5]。RNA干扰技术具有效率高、特异性强、抑制作用迅速、操作简单、设备依赖性低等优点[6]，在肿瘤治疗方面表现出了其他治疗方案无法比拟的优势。
3.关于靶向Survivin-shRNA在动物体内的研究机制
目前针对靶向Survivin-shRNA在肿瘤生长抑制方面做了很多研究，但多局限于对肿瘤细胞的研究，而对肿瘤动物模型研究少见。靶向Survivin-shRNA对动物体内肿瘤抑制作用是多方面的，如抑制肿瘤生长、抑制肿瘤内的血管生成、增加放化疗药物的敏感性等。
3.1抑制肿瘤的生长ShenYM[7]等研究者，构建4组SurvivinshRNA重组质粒，分别为pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2和阴性对照重组质粒pGenesil-1-NC，胰腺癌Patu8988细胞接种BALB/c裸鼠，建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，观察瘤体积和瘤重量，用免疫组化测定Survivin蛋白表达。pGenesil-1-Survivin-1组、pGenesil-1-Survivin-2组和pGenesil-1-Survivin-1+2组平均瘤体积、瘤重量明显下降；切片的免疫组化结果显示：瘤体组织大片状坏死，影响蛋白的正常表达。SurvivinshRNA重组质粒抑制了胰腺肿瘤的生长。
Peng[8]等研究者建立人子宫内膜裸鼠皮下种植模型，分别为survivin-shRNA慢病毒(治疗)组、空载慢病毒(阴性对照)组及磷酸盐缓冲液(空白对照)组。观察3组异位病灶的形态、重量、体积及组织学情况；TUNEL法检测异位内膜细胞的凋亡情况。shRNA慢病毒治疗组的病灶体积、重量显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.001)，shRNA慢病毒治疗组的种植内膜细胞凋亡率显著高于其他两组(P<0.001)，shRNA慢病毒治疗组病灶在光镜下可见腺体萎缩，腺体结构不完整，间质伴有不同程度的坏死。慢病毒介导survivin基因特异性shRNA能显著促进裸鼠皮下异位病灶组织的细胞凋亡，抑制裸鼠子宫内膜异位病灶的种植生长。
还有学者[9]培育了结直肠癌移植瘤模型，构建重组腺病毒载体pBAsi-Survivin，在干预的第1、4天时，转染组与空载体及空白对照组的体积变化无统计学意义，在第7、10、13、16、19天，差别有统计学意义（P<0.05）。随着时间的延长转染组体积增长减慢，肿瘤的生长抑制作用更加明显。Survivin的mRNA及蛋白表达明显下降。Suvivin-siRNA重组载体能显著抑制结直肠癌裸鼠移植瘤的增殖。
3.2抑制肿瘤血管的生成Peng[10]等研究者建立鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)子宫内膜异位症模型，随机分成单纯接种组、shRNA慢病毒组、空载慢病毒组和空白载体组，每组30只，通过Image-proplus软件测量新生血管面积与鸡胚尿囊膜面积比(VA/CAM)评价沉默Survivin基因对CAM血管生成的影响，shRNA慢病毒处理组种植内膜VA/CAM明显低于单纯接种组、空载慢病毒组和空白载体组(P<0.001)，
凋亡率明显高于其他3组(P<0.05)，慢病毒处理组病灶在光镜下可见腺体结构不完整，间质伴有不同程度的坏死。慢病毒介导survivin基因特异性shRNA能够显著抑制人子宫内膜异位症种植CAM模型的新生血管形成，抑制子宫内膜在CAM上的种植生长。
杜娟[11]等研究者体外培养血管瘤内皮细胞种植裸鼠皮下建立裸鼠人血管瘤动物模型，并用脂质体包裹SurvivinASODN干预，ASODN/lip组裸小鼠种植瘤的体积随着注入ASODN后时间的延长和浓度的增加，种植瘤生长越来越小，并呈时间一剂量一效应依赖性。用免疫组化染色后，空白对照组和SODN/lip组均有明显的Survivin和VEGF蛋白表达，表达较强。而ASODN/lip组则明显下降，Survivin和VEGF蛋白均表达较低，数量减少，颜色变淡。ASODN/lip组的微血管密度（MVD）明显小于其它两组。SurvivinASODN体内转染可有效抑制体内人血管瘤种植瘤的生长速度，抑制瘤体血管形成。
3.3提高放化疗药物的敏感性Hu[12]等研究者通过shRNA下调生存素的表达来观察喉鳞癌细胞对放疗的敏感性，通过对荷瘤小鼠进行放疗，每隔4天测量一次肿瘤体积，结果显示Survivin-shRNA联合放疗组比单独用Survivin-shRNA组肿瘤体积明显减小。这表明靶向Survivin-shRNA明显提高了肿瘤细胞对放疗的敏感性。通过shRNA下调Survivin来提高喉癌放疗敏感性，同时也可以减少放疗对正常组织的损伤，这对于喉癌的治疗有重大意义。
Tian[13]等研究者构建裸鼠肺癌H929模型，SurvivinshRNA联合小剂量顺铂联合治疗，结果表明，联合治疗组的MVD比单独用SurvivinshRNA或顺铂治疗组的MVD显著降低（P<0.05），联合治疗组平均肿瘤体积比单独用SurvivinshRNA或顺铂治疗组的平均肿瘤体积显著降低（P<0.05），靶向Survivin-shRNA可以增加化疗药物对肺癌H929治疗作用敏感性，提示在化疗药物治疗肺癌中可以联合应用SurvivinshRNA，以提高疗效。
4.小结
关于靶向Survivin-shRNA对肿瘤抑制作用的研究，已经在胰腺癌、肝癌、胃癌等各类肿瘤中展开。其利用于诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖的研究已经取得了很大的进展，但是目前的研究多局限于对肿瘤细胞的研究，而应用动物模型的研究较少。由于动物模型的获得需控制的实验条件因素较多，对技术及实验室条件要求较高，所以现在的研究多集中于对肿瘤细胞的研究。而动物模型实验比肿瘤细胞实验更能准确的模拟肿瘤的发生和发展过程，有助于肿瘤病理的观察和新药物的开发。因此，通过前期动物模型的研究，可以更加明确抗肿瘤药物的疗效及安全性，为后期人体临床实验提供理论基础[14]。随着基因工程学和分子生物学的发展，使转基因动物模型成为可能，为人类肿瘤模型的研究提供了新的概念，动物模型的应用前景将会变的更加广阔。
参考文献
[1]GargH,SuriP,GuptaJC,etal.Survivin:auniquetargetfortumortherapy[J].CancerCellInt,2016,23;16:49.
[2]郝玉琴.Survivin与皮肤病的研究进展[J].中国麻风皮肤病杂志,2011,27(4):261.
[3]ShamsabadiFT1,EidgahiMR,MehrbodP,etal.Survivin,aPromisingGeneforTargetedCancerTreatment[J].AsianPacJCancerPrev.2016;17(8):3711-9.
[4]Itak.Dermal/transdermaldeliveryofsmallinterferingRNAandantisenseoligonucleotides-advancesandhurdles[J].BiomedPharmacother.2017,5;87:311-320.
[5]TijstermanM,KettingRF,PlasterkRH.ThegeneticofRNAsilencing[J].AnnuRevGenet,2002,36:489-519.
[6]MansooriB,SandoghchianShotorbaniS,BaradaranB.RNAinterferenceanditsroleincancertherapy[J].AdvPharmBull.2014,4(4):313-21.
[7]ShenYM,YangXC,SongML,etal.GrowthinhibitioninducedbyshorthairpinRNAtosilencesurvivingeneinhumanpancreaticcancercells[J].HepatobiliaryPancreatDisInt.2010,9(1):69-77.
[8]PengD,HeY.Lentiviralvector-mediatedshorthairpinRNAtargetingsurvivininhibitsabdominalgrowthofhumanendometriumxenograftinnudemice[J].NanFangYiKeDaXueXueBao.2015,35(2):281-3
[9]李日恒,张娇,李山峰,等.RNA干扰沉默survivin基因对结直肠癌裸鼠移植瘤的影响[J].中国老年学杂志,2014,(15):4274-4275.
[10]PengD,HeY,QiuL.Effectoflentiviralvector-mediatedshorthairpinRNAtargetingsurvivinagainstendometriosis-likelesionsinchickembryochorioallantoicmembrane[J].NanFangYiKeDaXueXueBao.2012,32(7):995-9
[11]杜娟.Survivin反义寡核苷酸对裸鼠人血管瘤种植瘤血管生成的影响[D].蚌埠医学院,2011.
[12]ParkE,GangEJ,HsiehYT,etal.TargetingcomesdrugresistanceinacutelymphoblasticLeukemia[J].Blood,2011,118(8):2191-2199.
[13]TianH,LiuS,ZhangJ,ZhangSetal.Enhancementofcisplatinsensitivityinlungcancerxenograftsbyliposome-mediateddeliveryoftheplasmidexpressingsmallhairpinRNAtargetingSurvivin[J].JBiomedNanotechnol.2012,8(4):633-41.
[14]SteiMM,LoefflerKU,HolzFG,etal.AnimalModelsofUvealMelanoma:Methods,Applicability,andLimitation[J].BiomedResInt.2016:4521807.
国家自然科学基金资助项目[编号：81260407]