维康颗粒对疲劳型亚健康大鼠下丘脑蛋白谱的影响

论文摘要

【背景】20世纪80年代中期,前苏联布赫曼教授通过研究发现,除了健康状态和疾病状态之外,人体还存在着一种非健康非患病的中间状态,称为亚健康状态（sub-health status）。世界卫生组织的一项全球性调查表明,真正健康的人仅占5%,患有疾病的人占20%,而75%的人处于亚健康状态。亚健康状态在经济发达、社会竞争激烈的国家和地区中普遍存在,人数一直呈逐年增加的趋势,成为国际上医学界研究的热点之一。亚健康的临床表现多种多样,而通过本课题组的大规模亚健康流行病学调查研究表明,其中疲劳不仅是亚健康状态的重要临床表现之一,也是导致亚健康发生发展的重要原因,疲劳型亚健康是亚健康的主要类型之一。因此,阐明疲劳型亚健康的发生机制,不仅有助于深入亚健康的病因学研究,而且可以采取积极的措施干预疲劳型亚健康的发生发展,会对疲劳型亚健康的防治产生积极的影响,进入良性循环,向健康方向转化。在目前有关疲劳型亚健康的研究中,建立较理想的疲劳型亚健康模型是研究得以深入的关键。然而目前尚未有比较理想、公认的疲劳型亚健康模型,而动物实验作为现代生物医学研究中的一个极为重要的实验方法和手段,具有可控性好、结果易获得、简便性好、容易复制等优点,为研究疲劳型亚健康的发生、发展规律及防治措施,研制疲劳型亚健康动物模型具有重要的意义。以往研究表明下丘脑在疲劳的形成中起有重要的调节作用,而蛋白质组学双向电泳技术为研究疲劳发生机制新的有效技术手段。因此,通过制备疲劳型亚健康大鼠模型,利用蛋白质组学的实验技术,着手于整体,全面观察疲劳型亚健康大鼠以及维康颗粒干预后疲劳型亚健康大鼠的下丘脑蛋白谱变化,为进一步识别疲劳型亚健康的生物标志物,探讨疲劳型亚健康发生发展机制,以及维康颗粒抗疲劳型亚健康的相关作用机制提供研究基础。【目的】建立疲劳型亚健康大鼠模型,运用蛋白质组学双向电泳技术初步研究疲劳型亚健康的发生机理,及维康颗粒抗疲劳型亚健康的作用机制。【方法】1.运用睡眠剥夺和负重力竭游泳的复合方法进行造模,即将模型组大鼠放入水深1.5 cm的盒子中剥夺睡眠,按其体质量5%负重后再于水深50cm的玻璃缸内进行力竭游泳训练,以沉入水中10s无法浮出水面判定达到力竭状态;正常空白对照组不给予任何刺激,自然饲养。经两次实验确定睡眠剥夺强度和总的造模时间,以建立疲劳型亚健康大鼠模型,以力竭游泳时间和大鼠血液生化指标为衡量标准,对建立的模型进行评估。实验一:确定睡眠剥夺强度,将SPF级健康雄性SD大鼠32只,随机分为20h/d（每天剥夺睡眠时间20h）、16h/d（每天剥夺睡眠时间16h）、12h/d模型组（每天剥夺睡眠时间12h）和空白对照组（不剥夺睡眠）,每组8只,将模型组大鼠负重力竭游泳13d,观察大鼠力竭游泳时间的变化,试验结束后。采大鼠血清检测生化ALT、AST、TP、Alb、TBIL、BUN、Scr、UA、LDH、CK、GLU、TG、Tch及CRP值,对照空白组分析各实验组生化值的变化,依据上述两项内容确定大鼠睡眠剥夺强度。实验二:确定造模时间,依据实验一力竭游泳时间和生化值的变化,确定实验组为1d（造模时间为1d）、4d（造模时间为4d）、5d（造模时间为5d）实验组和空白对照组,采各组大鼠血清检测生化ALT、AST、TP、Alb、TBIL、BUN、Scr、UA、LDH、CK、GLU、TG、Tch及CRP值,空白对照组分析各实验组生化值的变化,以确定造模天数。2.在造模过程中给予大鼠维康颗粒干预,比较给药组、未给药模型组及空白对照组,以力竭游泳时间为衡量疲劳的标准,观察维康颗粒抗疲劳作用。3.统计学分析采用SPSS13.0 for windows统计软件包处理,同组不同时间点间比较、多个处理组与一个空白对照组比较采用单向方差分析（One-WayANOVA）;重复测量资料采用重复测量数据的方差分析,显著性水准α=0.05,P＜0.05为差异有统计学意义。4.运用蛋白质组学双向电泳技术,对正常组、模型组及给药组大鼠下丘脑蛋白点分离,依据蛋白图谱分析软件PDQuest分析下丘脑蛋白谱,发现有差异的蛋白点,找到与疲劳型亚健康发生及维康颗粒抗疲劳作用机制相关的蛋白。【结果】1.实验一:20h模型组力竭游泳时间随着实验天数的增加出现明显的改变,呈逐渐降低的趋势,第13d与第0d相比较明显缩短,差异有显著的统计学意义（P＜0.01）,同时血清生化AST、LDH、ALB、GLU、Tch出现了明显的异常,差异均有统计学意义（P＜0.05,0.01）。16h、12h模型组力竭游泳时间随着造模天数的增加并无下降,且生化指标与正常组相比较差异无统计学意义（P＞0.05）。2.实验二:与空白对照组比较,5d模型组中AST、ALT、BUN、Scr、HBDH、CK、TG、Tch水平有明显的改变,差异有明显的统计学意义（P＜0.05,0.01）,1d、4d模型组大鼠生化值差异无统计学意义（P＞0.05）。3.造模4d后两组大鼠力竭游泳时间相比较,给药组大鼠力竭游泳时间明显延长,两组之间差异有显著的统计学意义（P＜0.05）。4.运用蛋白质组学双向电泳技术分别对空白对照组、模型组、维康颗粒高剂量给药组大鼠下丘脑蛋白进行蛋白点的2-D分离,与空白对照组相比较,模型组共有71个点有明显差异,维康颗粒高剂量给药组有65个蛋白点有明显差异,其中模型组中蛋白点表达上升2倍及以上的点有18个,下降2倍及以上的点有15个;给药组中蛋白点表达上升2倍以上的点有12,下降2倍及以上的点有9个。其中模型组与空白对照组的差异71个点中,有32个差异点经维康颗粒干预后,有明显恢复,接近于正常。这些蛋白质的存在,可能与疲劳型亚健康发生的机制和维康颗粒抗疲劳型亚健康的作用靶点相关。【结论】1.本研究成功的运用每日睡眠剥夺20h复合负重其体重5%力竭游泳的作用因素,造模4d,建立了大鼠疲劳型亚健康模型。2.维康颗粒有延长大鼠力竭游泳时间,对疲劳型亚健康大鼠有抗疲劳的作用。3.本研究利用蛋白质组学双向电泳技术分析各组大鼠下丘脑蛋白图谱,发现与疲劳型亚健康发生和维康颗粒抗疲劳型亚健康的相关蛋白,初步揭示其发生机制。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1.亚健康是当今危害人类健康的头号隐形杀手
• 2.亚健康的现代医学研究现状
• 3.疲劳型亚健康与下丘脑及中枢神经系统的关系
• 4.蛋白质组学研究技术为中医药研究提供了新的方法
• 5.中医对疲劳型亚健康的认识
• 6.本研究的整体构思
• 第1章 疲劳型亚健康大鼠模型的制作
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 器材
• 1.3 试剂
• 2 方法
• 2.1 睡眠剥夺时间的确定
• 2.2 造模时间的确定
• 3 结论
• 第2章 维康颗粒对疲劳型亚健康大鼠的力竭游泳时间及下丘脑蛋白谱的影响
• 1. 维康颗粒对模型大鼠的力竭游泳时间的影响
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 结论
• 2. 维康颗粒对疲劳型亚健康大鼠下丘脑蛋白谱的影响
• 2.1 材料
• 2.2 仪器
• 2.3 方法
• 2.4 结果
• 2.5 讨论
• 3. 结论
• 第3章 讨论
• 1.疲劳型亚健康动物模型的建立
• 2.维康颗粒对疲劳型亚健康模型大鼠的抗疲劳作用
• 3.疲劳型亚健康模型大鼠维康颗粒干预后下丘脑蛋白质组学研究
• 全文小结
• 研究创新点
• 研究不足之处
• 下一步研究工作
• 参考文献
• 综述
• 成果
• 致谢
• 统计学审稿证明