农杆菌介导的DHAR基因转化甜瓜和苹果的研究

论文摘要

植物在逆境胁迫下会产生大量具有毒害作用的活性氧,活性氧的清除系统对于植物维持其正常生理功能具有重要意义。甜瓜和苹果都是人们喜爱的水果,其果实香甜,风味可口。利用生物技术培育高营养,抗逆的新品种是目前育种的主要目标之一。通过基因工程的方法提高活性氧清除酶活性,从而提高植物的抗氧化胁迫的能力,可为选育具有高抗逆性的新品种奠定基础;并为研究其代谢途径以及在抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的作用奠定基础。本文主要研究结果如下:1以薄皮甜瓜品种‘西甜一号’的子叶和叶片为外植体,通过器官发生途径诱导形成不定芽,探讨了不同的激素组合、叶龄、外植体放置方式、有无暗培养等条件对其再生的影响。结果表明,5-7 d龄的子叶块在MS+6-BA0.8 mg/L的诱导培养基上,继代后生长两周左右的叶片在MS+6-BA1.0 mg/L的诱导培养基上,远轴面向下接触培养基,直接转入正常光周期下培养均可100%再生。在MS+6-BA0.05 mg/L不定芽伸长培养基上,分化的不定芽（丛）能够伸长长大。在1/2MS+IAA0.2 mg/L生根培养基上无根苗发根,生根率可达100%。2构建了脱氢抗坏血酸还原酶基因（DHAR,序列号DQ322706,克隆自‘嘎啦’苹果叶片）植物表达双元载体并将其导入根癌农杆菌中。3在建立甜瓜子叶再生体系和构建表达载体的基础上,以‘西甜一号’甜瓜的子叶作为外植体,利用根癌农杆菌介导法将DHAR基因转入甜瓜。以潮霉素的抗性植株和PCR呈阳性的植株作为转化植株的初步判定,研究了影响转化的因素。子叶经2 d预培养,于OD600值为0.6的菌液中侵染8 min,3 d的共培养,潮霉素压力为4 mg/L,抑菌素头孢霉素浓度为500 mg/L的条件下,转化率最高,经过PCR检测后初步确定17株抗性植株为阳性转化植株。4对甜瓜阳性转化植株中的6个株系的抗坏血酸水平进行测定,其总AsA含量得到明显的提高,最高增加了2倍多,但大部分株系氧化还原能力未有明显的变化。这些结果初步表明,苹果DHAR基因成功的转入了甜瓜,并且DHAR的过量表达能提高AsA含量。5采用本实验室前人研究的‘长富2号’苹果再生体系和遗传转化体系,将DHAR基因转化‘长富2号’苹果,经过PCR检测后初步确定1株抗性植株为阳性转化植株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物抗坏血酸和脱氢抗坏血酸还原酶的研究进展
• 1.1.1 植物抗坏血酸的研究
• 1.1.2 抗坏血酸对抵抗植物逆境胁迫的研究
• 1.1.3 植物脱氢抗坏血酸还原酶及其遗传转化的研究
• 1.2 甜瓜组织培养及遗传转化的研究进展
• 1.2.1 甜瓜组织培养研究进展
• 1.2.2 影响甜瓜再生频率的因素
• 1.2.3 甜瓜遗传转化的研究进展
• 1.2.4 存在的问题与展望
• 1.3 苹果遗传转化的研究进展
• 1.3.1 苹果遗传转化取得的成果
• 1.3.2 农杆菌介导的转化系统的研究
• 1.3.3 苹果遗传转化中存在的问题及展望
• 1.4 本试验的目的和意义
• 第二章 甜瓜再生体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 无菌外植体的获得
• 2.1.4 子叶外植体的处理
• 2.1.5 叶片外植体的处理
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同浓度组合的6-BA 和IAA 对子叶和叶片不定芽发生的影响
• 2.2.2 叶龄对再生的影响
• 2.2.3 暗培养时间对再生的影响
• 2.2.4 外植体放置方式对再生的影响
• 2.2.5 再生不定芽的伸长与生根
• 第三章 DHAR 基因植物表达双元载体的构建
• 3.1 试验材料与方法
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 酶及生化试剂
• 3.1.3 PCR 引物
• 3.1.4 植物表达双元载体pCSB-DHAR 的构建
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 中间表达载体的构建及鉴定
• 3.2.2 脱氢抗坏血酸还原酶基因植物表达载体的构建
• 3.2.3 根癌农杆菌的转化及鉴定
• 第四章 DHAR 基因转化甜瓜植株的获得
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 培养基配方
• 4.1.3 甜瓜子叶抗生素敏感性的确定
• 4.1.4 根癌农杆菌介导甜瓜的转化
• 4.1.5 抗性植株的再生
• 4.1.6 转基因植株的PCR 检测
• 4.1.7 PCR 检测阳性株系AsA 和DHA 含量的测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 甜瓜子叶潮霉素抗性筛选
• 4.2.2 抑菌素浓度对农杆菌生长的影响
• 4.2.3 预培养对转化效率的影响
• 4.2.4 不同菌液浓度和侵染时间对甜瓜转化效率的影响
• 4.2.5 共培养对转化效率的影响
• 4.2.6 甜瓜抗性植株的获得与转基因植株的PCR 鉴定
• 4.2.7 甜瓜叶片AsA 和DHA 含量
• 第五章 DHAR 基因转化苹果植株的获得
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料与试剂
• 5.1.2 培养基配方
• 5.1.3 苹果叶片潮霉素（Hyg）选择压的确定
• 5.1.4 根癌农杆菌介导苹果的转化
• 5.1.5 抗性植株的再生
• 5.1.6 转基因植株的PCR 检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 苹果叶片潮霉素抗性筛选
• 5.2.2 苹果转基因植株的PCR 鉴定
• 第六章 讨论
• 6.1 甜瓜子叶和叶片再生体系的建立
• 6.2 甜瓜遗传转化体系的建立
• 6.3 抗生素浓度对叶片遗传转化的影响
• 6.4 选择方式和外植体放置方式对转化的影响
• 6.5 载体构建
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介