硫辛酸抗氧化作用及对小牛主动脉内皮细胞和平滑肌细胞氧化损伤的保护功效研究

论文摘要

α-硫辛酸（lipoic acid,LA）广泛存在于各种细胞中。α-硫辛酸在哺乳动物细胞内可以部分转化为还原型的二氢硫辛酸（dihydrolipoic acid,DHLA）。自发现LA以来,对其生物活性已经进行了许多体内、体外和细胞实验研究。研究表明,LA对糖尿病、白内障、局部缺血再灌注和放射性损伤等自由基性疾病具有预防和治疗作用。但LA对保护动脉血管细胞免受氧化损伤的功能研究较为少见。 本研究采用化学发光法和比色法全面检测了LA和DHLA直接清除多种自由基、活性氧和抗脂质过氧化的能力以及对·OH引起的DNA氧化损伤的保护作用,并且体外培养小牛主动脉内皮细胞（endothelial cells,EC）和平滑肌细胞（smooth muscle cells,SMC）,建立细胞H2O2氧化损伤模型,研究了LA保护EC和SMC免受H2O2氧化损伤的功效,以及产生这些功效的自由基生物学机理。 清除自由基和活性氧的实验表明,LA和DHLA不仅可以有效清除相应体系中的羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）、过氧亚硝基阴离子（ONOO-）和二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）,显著抑制脂质过氧化,而且对·OH引起的DNA损伤也有良好的保护功效。LA不能清除超氧阴离子（O2-）,而DHLA可以有效清除O2-。以上结果提示,DHLA的抗氧化能力明显强于LA。 四甲基偶氮噻唑盐（MTT）比色法实验结果表明,LA可促进EC的增殖而抑制SMC的增殖。LA对EC和SMC由H2O2引起的氧化损伤的保护作用的实验结果显示,在H2O2胁迫下,LA可剂量依赖性地升高EC和SMC中的超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性及还原型谷胱甘肽（GSH）的含量,抑制细胞内外的ONOO-和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的产生。 结果表明,LA和DHLA能有效清除多种自由基和活性氧,抑制脂质过氧化,对·OH引起的DNA氧化损伤有保护作用,提示它们是良好的抗氧化剂。LA可促进EC的增殖而抑制SMC的增殖,同时LA可以提高H2O2胁迫下EC和SMC的抗氧化水平,改善H2O2胁迫下EC和SMC的多种生化指标,对EC和SMC的氧化损伤有保护功效。这些结果提示LA可能具有防止AS的发生和发展,缓解AS病情的作用。本研究为LA和DHLA药用保健价值的进一步开发提供了自由基生物学方面的新的实验依据。

论文目录

• 论文摘要（中文）
• 论文摘要（英文）
• 前言
• 实验仪器及材料
• 实验方法
• 1 测定α-硫辛酸（LA）和二氢硫辛酸（DHLA）抗氧化作用的实验方法
• 2^-的化学发光体系'>1.1 产生0₂^-的化学发光体系
• 1.2 产生·OH的化学发光体系
• 2O₂化学发光体系'>1.3 H₂O₂化学发光体系
• -）的化学发光体系'>1.4 产生过氧亚硝基阴离子（ONOO^-）的化学发光体系
• 2+诱发脂质过氧化体系'>1.5 Fe²⁺诱发脂质过氧化体系
• ·）比色体系'>1.6 二苯代苦味肼基自由基（DPPH^·）比色体系
• 1.7 ·OH引起DNA损伤的化学发光体系
• 2 测定LA对小牛主动脉内皮细胞利平滑肌细胞氧化损伤保护作用的实验方法
• 2.1 小牛主动脉内皮细胞（EC）的培养
• 2.1.1 EC原代培养
• 2.1.2 EC传代培养
• 2.2 小牛主动脉平滑肌细胞（SMC）的培养
• 2.2.1 SMC原代培养
• 2.2.2 SMC传代培养
• 2.3 LA对EC和SbtC增殖的影响
• 2O₂及LA对培养细胞的作用'>2.4 H₂O₂及LA对培养细胞的作用
• 2O₂损伤模型建立'>2.4.1 细胞H₂O₂损伤模型建立
• 2.4.2 实验分组
• 2.4.3 细胞裂解液的制备
• 2.4.4 细胞裂解液中蛋白含量测定
• 2.4.5 细胞内过氧化氢酶（CAT）活性测定
• 2.4.6 细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
• 2.4.7 细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）含量测定
• 2.4.8 细胞内脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量测定
• -含量测定'>2.4.9 细胞内外的ONOO^-含量测定
• 结果与分析
• 1 LA和DHLA抗氧化作用
• 2^-的清除作用'>1.1 对O₂^-的清除作用
• 1.2 对·OH的清除作用
• 2O₂的清除作用'>1.3 对H₂O₂的清除作用
• -的清除作用'>1.4 对ONOO^-的清除作用
• 1.5 抗脂质过氧化作用
• ·的清除作用'>1.6 对DPPH^·的清除作用
• 1.7 对·OH引起的DNA损伤的保护作用
• 2 LA对离体培养的小牛主动脉EC和SMC氧化损伤的保护作用
• 2.1 小牛主动脉EC和SMC的形态学鉴定
• 2.2 LA对小牛主动脉EC增殖的促进作用和SMC增殖的抑制作用
• 2O₂细胞损伤模型的建立'>2.3 小牛主动脉EC和SMC的H₂O₂细胞损伤模型的建立
• 2O₂氧化胁迫下EC和SMC的CAT活性的影响'>2.4 LA对在H₂O₂氧化胁迫下EC和SMC的CAT活性的影响
• 2O₂氧化胁迫下EC和SMC的SOD活性的影响'>2.5 LA对在H₂O₂氧化胁迫下EC和SMC的SOD活性的影响
• 2O₂氧化胁迫下EC和SMC的GSH含量的影响'>2.6 LA对在H₂O₂氧化胁迫下EC和SMC的GSH含量的影响
• 2O₂氧化胁迫下EC利SMC的MDA含量的影响'>2.7 LA对在H₂O₂氧化胁迫下EC利SMC的MDA含量的影响
• 2O₂氧化胁迫下EC和SMC内外ONOO^-含量的影响'>2.8 LA对在H₂O₂氧化胁迫下EC和SMC内外ONOO^-含量的影响
• 讨论
• 1 LA和DHLA体外清除自由基和活性氧的作用
• 2 LA对小牛主动脉EC和SMC氧化损伤的保护作用
• 参考文献
• 综述：α-硫辛酸和二氢硫辛酸研究进展
• 研究生期间发表论文
• 致谢