人肝癌多药耐药机制的系列研究

论文摘要

目的研究人肝癌多药耐药产生的机理及耐药性产生之后生物学行为的变化，发夹状RNA（small hairpin RNA，shRNA）对人肝癌多药耐药细胞株的逆转效果。方法建立人肝癌HepG2多药耐药细胞系HepG／ADM，检测其部分生物学性状，并设计两条针对MDR1基因的shRNA，观察其对多药耐药细胞的逆转效果。（1）HepG2／ADM的建立及其鉴定：应用HepG2细胞系，通过培养液中阿霉素的浓度梯度递增法，长期筛选培养，得到人肝癌多药耐药株HepG2／ADM。以MTT法检测HepG2／ADM的多药耐药性；用流式细胞术检测其细胞周期的分布，细胞内的药物浓度及加药后细胞周期的变化；用荧光定量RT-PCR方法检测多药耐药基因MDR1、LRP、MRP、BCRP的基因表达水平；Western-blotting增强化学发光法（Enhanced chemilluminesence，ECL）检测细胞株表面MDR1蛋白P-gp、多药耐药相关蛋白MRP、LRP及BCRP的表达水平。（2）HepG2／ADM细胞生物学行为变化的研究：利用透射电镜研究人肝癌多药耐药细胞HepG2／ADM及其亲本细胞HepG2的超微结构；利用荧光定量PCR技术检测脂质过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARα）mRNA及胚胎发育相关基因Twist在两种细胞系中的表达水平；利用Western-blotting增强化学发光法检测PPARα蛋白及Twist蛋白在两种细胞中的表达情况。（3）shRNA对HepG2／ADM细胞耐药性逆转的研究：设计两条针对MDR1基因的shRNA，并将其分别构建在pGenSil-1质粒中；然后将这两条shRNA分别转染HepG2／ADM细胞；利用罗丹明外排法、荧光定量PCR及细胞毒性实验来检测这两条shRNA对HepG2／ADM的多药耐药性的逆转作用。结果（1）HepG2／ADM的建立及其鉴定：经MTT法检测，HepG2／ADM细胞与HepG2细胞相比，对长春新碱（VCR）等8种抗癌药的抗性提高了1.22～107.56倍；耐药细胞的倍增时间延长2.05倍，细胞周期的分布则无明显改变；阿霉素对细胞周期有明显的影响，加阿霉素后细胞先是阻滞于G2期，继而大量凋亡；该耐药模型的MDR1及BCRP基因表达上调（p＜0.01），其中以MDR1基因表达上调最为明显，其mRNA表达是其亲本细胞的近1000倍，但多药耐药相关蛋白LRP无明显变化，MRP反而轻微下调。（2）HepG2／ADM细胞生物学行为的变化：透射电镜扫描表明，与其亲本细胞相比，耐药细胞的核膜上绒毛样突起增多，胞浆内有大量空泡，粗面内质网增多；PPARαmRNA及PPARα蛋白表达在HepG2／ADM细胞中下调；Twist在HepG2／ADM中表达上调，与其亲本细胞HepG2相比，mRNA（9.34 vs 1，p＜0.05），蛋白（10.64±0.56 vs 1，p＜0.05），具有显著性差异。（3）shRNA可以完全逆转HepG2／ADM细胞的耐药性：在稳定转染针对MDR1基因的shRNA的细胞中可以观察到不同程度的MDR逆转现象，在其中的两个稳定转染的克隆中，MDR现象被完全逆转。结论（1）HepG2／ADM细胞是一个明确的多药耐药模型，具有耐药细胞的基本特性，其多药耐药性可能主要与MDR1及BCRP的高表达有关，其中前者起主要作用，后者起辅助作用。可以利用这个模型对人肝癌的多药耐药机制进行深入研究。同亲本细胞相比，对长春新碱（VCR）等8种抗癌药的抗性提高了1.22～107.56倍、倍增时间延长2.05倍、细胞内药物蓄积明显降低、细胞周期分布无明显改变；其多药耐药性主要与MDR1的高表达有关。G2期可能是阿霉素使细胞凋亡的检测点。（2）与其亲本细胞相比，HepG2／ADM细胞生物学行为发生了改变。PPARα与HepG2／ADM细胞的多药耐药现象有关，PPARα表达下调可能是肿瘤细胞多药耐药性形成的机制之一；也可能是肿瘤细胞产生耐药性后的结果，耐药细胞可能通过下调PPARα表达而产生一些生物学行为上的变化。这两种猜测都有待于进一步的研究证实。Twist在HepG2／ADM中表达上调。鉴于Twist是一个调控肿瘤细胞转移扩散的开关基因，因此，我们推测，与其亲本细胞相比，HepG2／ADM细胞的转移扩散能力增加。（3）可以利用shRNA逆转HepG2／ADM细胞的多药耐药问题，这为临床逆转人原发性肝细胞癌的多药耐药问题提供了新的线索。

论文目录

• 前言
• 摘要
• Abstract
• 论文正文
• 第一部分 人原发性肝癌HepG2多药耐药细胞系的建立
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 耐药细胞系的鉴定
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 人原发性肝癌HepG2多药耐药细胞系的部分生物学性状的研究
• 一、脂质过氧化物酶体增殖物激活受体α在人肝癌多药耐药中的作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 二、Twist基因表达与肝癌多药耐药细胞侵袭的相关性研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 shRNA对人肝癌细胞多药耐药能力的完全逆转
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 文献综述
• 1.肿瘤多药耐药机制研究进展
• 2.肿瘤多药耐药逆转的研究进展
• 附录一 （实验研究所用之主要仪器设备及耗才）
• 附录二 （常用试剂配方）
• 附录三 （Western Blotting操作步骤）
• 附录四 （攻读学位期间发表的论文）
• 致谢