奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌凝聚因子A A区基因的克隆表达

论文摘要

乳腺炎是奶牛的一种常见病和多发病,其发生的主要原因是病原微生物感染。引起乳腺炎的病原微生物多达80多种,主要包括细菌、霉形体、真菌及病毒。细菌性病原微生物中,金黄色葡萄球菌占主要地位,但多年来对金黄色葡萄球菌性乳腺炎的防治一直没有有效的措施,本文拟对金黄色葡萄球菌凝聚因子A A区基因进行克隆表达,为研制预防金黄色葡萄球菌性乳腺炎生物工程疫苗提供基础。本试验根据GeneBank公开发表的NewMan株ClfA A区序列设计引物,利用PCR方法对呼和浩特周边地区存在的4个主要的金黄色葡萄球菌基因型进行扩增,获得了金黄色葡萄球菌的凝聚因子A（ClfA）A区基因。实验对四株不同基因型的金黄色葡萄球菌的凝聚因子A（ClfA）A区基因进行克隆测序,与Genbank登陆的标准NewMan株ClfA A区序列进行比对,基因3型、基因9型、基因11型与NewMan株同源性较高,分别为97.8%、96.5%、98.3%,基因5型与Newman株同源性仅为85.4%。同时基因3型、基因9型、基因11型之间同源性也较高,而基因5型与另外三个基因型同源性也较低。将测定的序列用DNAstar软件进行抗原表位分析,基因3型、基因9型比NewMan株多一个抗原位点,因此选择了其中一个基因型即基因9型进行表达。将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a（+）中,获得了重组表达质粒pET- ClfA-A region。将其转化宿主菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,表达了ClfA-A区蛋白。经定位分析,目的蛋白以可溶形式存在。His·bind柱子纯化后获得纯度较高的ClfA-A region蛋白。纯化后的蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔,经三次免疫后得到了较高效价的抗血清。通过ELISA、试管凝集试验、抗体抗粘附能力检测、吞噬调理试验证明目的蛋白具有黏附活性,自制高免血清具有抗金黄色葡萄球菌黏附至牛纤维蛋白原的作用以及吞噬调理作用。实验证实所表达的蛋白为ClfA-A region蛋白。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 奶牛乳腺炎的分类
• 1.1.1 传染性奶牛乳腺炎
• 1.1.2 环境性奶牛乳腺炎
• 1.1.3 凝固酶阴性葡萄球菌感染的奶牛乳腺炎
• 1.2 奶牛乳腺炎的诊断与检测
• 1.2.1 临床型乳腺炎
• 1.2.2 隐性乳腺炎
• 1.2.3 乳汁病原微生物检查
• 1.3 奶牛金黄色葡萄球菌性乳腺炎
• 1.3.1 与金黄色葡萄球菌性奶牛乳腺炎相关的因素
• 1.3.2 金黄色葡萄球菌致病机理
• 1.3.3 金黄色葡萄球菌性奶牛乳腺炎的防治
• 1.3.4 凝聚因子A（clumping factor A, ClfA）简介
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 实验一 凝聚因子 A A 区基因的克隆
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 载体及菌种
• 2.1.2 试剂与工具酶
• 2.1.3 试验主要仪器
• 2.1.4 培养基与试剂按文献介绍的方法配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 目的片段的扩增及重组载体的构建
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 目的基因的扩增与克隆
• 2.3.2 重组质粒双酶切鉴定
• 2.3.3 序列测定及分析
• 2.3.4 抗原位点分析
• 2.4 讨论
• 2+浓度对 PCR 扩增的影响'>2.4.1 Mg²⁺浓度对 PCR 扩增的影响
• 2.4.2 序列测定及分析
• 2.4.3 抗原位点分析
• 3 实验二 凝聚因子 A A 区基因的表达及其检测方法的初步建立
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 载体及菌种
• 3.1.2 试剂与工具酶
• 3.1.3 试验主要仪器
• 3.1.4 培养基与试剂按文献介绍的方法配制
• 3.1.5 实验动物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 重组表达质粒的构建
• 3.2.2 融合蛋白的表达及分析
• 3.2.3 表达蛋白的纯化及分析
• 3.2.4 目的蛋白及其抗体的检测
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 重组表达载体双酶切鉴定
• 3.3.2 目的基因表达和SDS-PAGE 分析
• 3.3.3 表达产物的可溶性分析
• 3.3.4 表达产物的检测与分析
• 3.3.5 抗体抗黏附能力检测结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 目的蛋白的检测
• 3.4.2 试管凝集试验
• 3.4.3 吞噬调理作用
• 4 总体讨论
• 4.1 金黄色葡萄球菌特性
• 4.2 Boost
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介