利用RNA干涉技术进行水稻类受体激酶功能的研究

论文摘要

受体激酶作为外界环境信号分子的受体,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。RNAi技术是一种高通量研究基因功能的新手段。本研究利用RNAi（RNA interference）的方法初步研究水稻中两个类受体激酶基因OsCR4、OsPRK2的生物学功能。 选用pTCK303作为实施RNAi策略的双元载体。在OsCR4、OsPRK2基因的胞外域各选取一段DNA作为RNA干涉的片段,命名为OsCR4i、OsPRK2i,测序正确后分两次酶切连接,将RNAi片段先正向后反向两次连入pTCK303质粒中,完成pTCK303-CR4i、pTCK303-PRK2i的构建。 构建完成的双元载体通过农杆菌介导的方法转化水稻,经共培养、选择培养、分化培养后得到T0代转基因植株。转基因过程中对愈伤组织状态调控和农杆菌转化水稻的各个参数进行优化,结果表明NB培养基添加适量的氨基酸比较适合于愈伤组织的诱导;2,4-D浓度为2mg/l,6-BA浓度为0.5mg/l,二者组合是最佳激素组合;共培养过程农杆菌侵染浓度为OD600等于0.8-1.0,共培养时间为3-5天;降低农杆菌菌液浓度、共培养后充分洗涤并进行干燥处理的方法有利于抑制农杆菌的生长;接种前的低温处理和适当的干燥处理可提高分化率。本研究成功建立了一套转化效率可达到40%的水稻遗传转化体系。 对于得到的T0代转基因植株进行GUS染色,200株CR4转基因植株中GUS染色为阳性的有169株,188株PRK2转基因植株中GUS染色为阳性的有172株,转基因植株阳性率约为87%。从mRNA水平上分析,随机挑选的20株阳性植株分别提取RNA,用半定量RT-PCR的方法对其转录本进行检测,干涉CR4基因的20株阳性植株中有4株转录本水平下降;干涉PRK2基因的20株阳性植株中有5株转录本下降,干涉效率约为20%-25%。在表型观察上,干涉CR4基因的表达会引起叶片皱卷,这表明OsCR4基因可能与表皮细胞的分化有关;干涉PRK2基因在营养生长阶段没有观察到明显表型。由于温室条件所限,尚未收获到T0代种子。部分植株已移入大田,长势较好。

论文目录

• 目录
• 缩写表
• 摘要
• Abstract
• 第一篇 文献综述
• 第一章 受体激酶及其信号转导在植物生长发育中的作用
• 1.1 植物类受体激酶的进化
• 1.1.1 植物和动物类受体激酶的比较
• 1.1.2 植物类受体激酶家族
• 1.2 植物类受体激酶在发育过程中的作用
• 1.2.1 参与分生组织形成
• 1.2.2 调控花粉／柱头的相互作用
• 1.2.3 参与植物激素的信号转导
• 1.2.4 参与配子体发育
• 1.2.5 参与细胞形态建成和分化
• 1.2.6 调控植物器官的生长发育
• 1.2.7 启动体细胞胚胎发生
• 1.3 类受体激酶的信号转导
• 1.3.1 信号配基
• 1.3.2 类受体激酶信号转导的下游组分
• 1.4 水稻中的类受体激酶
• 第二章 RNAi技术在植物功能基因组学研究中的应用
• 2.1 RNAi的发现过程
• 2.2 RNAi的作用机理
• 2.2.1 RNAi的作用途径
• 2.2.2 参与RNAi过程的酶
• 2.3 RNAi的特点
• 2.3.1 RNAi序列的特异性
• 2.3.2 RNAi的高效性
• 2.3.3 RNAi的特殊穿越能力
• 2.4 RNAi技术在植物功能基因组学中的应用
• 第三章 农杆菌介导的水稻的遗传转化
• 3.1 水稻遗传转化方法
• 3.1.1 花粉管通道法
• 3.1.2 原生质体直接导入法
• 3.1.3 基因枪法
• 3.1.4 农杆菌介导法
• 3.2 农杆菌介导法转化单子叶植物的研究进展
• 3.2.1 农杆菌介导的遗传转化的机理
• 3.2.2 农杆菌介导的遗传转化的优越性
• 3.2.3 农杆菌介导的遗传转化在水稻中的应用
• 3.3 农杆菌介导法转化水稻的影响因素
• 3.3.1 水稻基因型
• 3.3.2 转化受体
• 3.3.3 农杆菌菌株与载体类型
• 3.3.4 Vir区基因的诱导
• 3.3.5 培养基组成和合适的培养条件
• 3.3.6 标记基因及筛选剂的选择
• 3.4 表达载体构建
• 3.4.1 启动子
• 3.4.2 终止子
• 3.4.3 报告基因
• 3.4.4 标记基因
• 第四章 研究的目的和内容
• 第二篇 研究报告
• 第一章 表达载体（pTCK303-CR4i、pTCK303-PRK2i）的构建
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 日本晴基因组DNA的提取
• 1.2.2 RNAi片段（OsCR4i和OsPRK2i）的扩增
• 1.2.3 RNAi（OsCR4i和OsPRK2i）片段测序
• 1.2.4 中间载体（pTCK303-CR4i-1、pTCK303-PRK2i-1）的构建
• 1.2.5 双元表达载体（pTCK303-CR4i、pTCK303-PRK2i）的构建
• 1.2.6 双元表达载体（pTCK303-CR4i、pTCK303-PRK2i）转化农杆菌
• 1.3 实验结果
• 1.3.1 日本晴基因组DNA的提取
• 1.3.2 RNAi片段（OsCR4i和OsPRK2i）的扩增
• 1.3.3 RNAi片段（OsCR4i和OsPRK2i）测序
• 1.3.4 中间载体（pTCK303-CR4i-1、pTCK303-PRK2i-1）的构建
• 1.3.5 双元表达载体（pTCK303-CR4i、pTCK303-PRK2i）的构建
• 1.3.6 双元表达载体（pTCK303-CR4i、pTCK303-PRK2i）转化农杆菌
• 第二章 农杆菌介导pTCK303-CR4i、pTCK303-PRK2i转化水稻
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 愈伤组织的诱导和继代培养
• 2.2.2 农杆菌的培养
• 2.2.3 共培养
• 2.2.4 选择培养
• 2.2.5 分化培养
• 2.2.6 壮苗培养
• 2.2.7 各种培养基列表
• 2.2.8 转化条件的优化
• 2.3 实验结果
• 第三章 转基因水稻的分子生物学鉴定及表型观察
• 3.1 材料和试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 转基因植株的GUS染色
• 3.2.2 半定量RT-PCR检测转基因植株的转录本
• 3.2.3 转基因植株的表型观察
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 转基因植株的GUS染色
• 3.3.2 RNA的电泳检测
• 3.3.3 半定量RT-PCR检测转基因植株的转录本
• 3.3.4 转基因植株的表型观察
• 第四章 讨论
• 4.1 表达载体（pTCK303-CR4i、pTCK303-PRK2i）的构建
• 4.1.1 载体的构建
• 4.1.2 农杆菌的鉴定
• 4.1.3 dsRNA的选择
• 4.1.4 影响RNAi干涉效率的因素
• 4.2 农杆菌介导pTCK303-CR4i、pTCK303-PRK2i转化水稻
• 4.2.1 愈伤状态的调控
• 4.2.2 共培养培养条件的优化
• 4.2.3 如何增强抑菌效果
• 4.2.4 如何提高绿苗分化率
• 4.2.5 如何提高转基因小苗成活率
• 4.3 转基因水稻的分子生物学鉴定及表型观察
• 4.3.1 GUS报告基因的选择
• 4.3.2 半定量RT-PCR检测转录本的注意事项
• 4.3.3 转基因水稻的表型观察
• 第五章 结论和需要进一步解决的问题
• 5.1 结论
• 5.2 需要进一步解决的问题
• 参考文献
• 附录Ⅰ 主要培养基母液及贮存液配制
• 附录Ⅱ RNAi载体构建示意图
• 致谢
• 个人简历