hu3D3/cSA介导的多药物肺癌预靶向治疗的初步研究

论文摘要

抗体介导的肿瘤靶向治疗已经成为抗肿瘤研究和临床应用的热点之一,但是传统的以抗肿瘤单抗为载体直接偶联效应分子的靶向治疗只能携带一种药物,往往不能达到理想的治疗效果,且免疫偶联物分子量较大,药物的组织穿透能力有限,从而限制了药物的使用剂量和临床应用。为克服上述不足,本研究旨在以人源化的抗人肺癌单域抗体（hu3D3）为靶向载体,通过引入链霉亲和素-生物素系统,构建一种能同时将多种药物携带至肿瘤部位的靶向通用载体,实现肺癌的预靶向多药物联合治疗。PCR扩增核心链霉亲和素基因,克隆至质粒hu3D3/pET-22b（+）,构建表达载体hu3D3/cSA/pET-22b（+）,并转化至E.coli BL21（DE3）中,IPTG诱导表达。镍亲和层析柱纯化目的蛋白,采用透析和凝胶过滤层析的方法对纯化产物进行复性。SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白四聚体的形成。FITC标记hu3D3/cSA后,荧光显微镜分析融合蛋白中hu3D3组分的抗原反应性和特异性;流式细胞术比较融合蛋白hu3D3/cSA和单域抗体hu3D3与靶抗原的结合能力。ELISA和Western blot鉴定融合蛋白中cSA组分结合生物素的能力。台盼蓝染色计数法观测各实验组的A549细胞生长曲线,MTT法比较各药物组对A549细胞的杀伤作用。结果表明,我们获得了正确序列的hu3D3/cSA/pET22b（+）重组子,融合基因在E.coli BL21（DE3）中主要以包涵体的形式表达。纯化复性后的融合蛋白能够形成四聚体复合物,保留了cSA结合生物素的活性,hu3D3组分能与肺癌细胞表面抗原结合,且结合能力比单域抗体hu3D3强6～9倍。生长曲线图表明,hu3D3/cSA联合生物素化药物组比单纯生物素化药物组的细胞存活率低25%～30%;细胞杀伤实验显示,与单纯的生物素化药物组相比,hu3D3/cSA介导的生物素化药物组对靶细胞A549的杀伤率提高了25%～35%。总之,我们通过基因工程技术成功表达了融合蛋白hu3D3/cSA,融合蛋白具有结合靶抗原和生物素的活性,同时改善了hu3D3组分的亲合力。体外细胞实验表明,hu3D3/cSA能介导多种生物素化的抗肿瘤药物实现肺癌的多药物预靶向治疗,为进一步探讨hu3D3/cSA在体内进行肺癌的预靶向治疗研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 一、抗体介导的肺癌靶向治疗
• 二、链霉亲和素-生物素系统在预靶向免疫治疗上的应用
• 三、抗人肺癌单克隆抗体3D3的研究进展和临床应用前景
• 四、研究目的和内容
• 第一章 融合蛋白hu3D3/cSA的表达及其活性鉴定
• 一、材料和方法
• 1 材料
• 1.1 菌株及质粒
• 1.2 主要试剂及耗材
• 1.3 主要仪器及设备
• 1.4 主要溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 hu3D3/cSA重组基因的设计
• 2.2 引物的合成
• 2.3 PCR扩增cSA基因
• 2.4 重组质粒的构建及其转化
• 2.5 重组子的筛选和序列分析
• 2.6 hu3D3/cSA在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.7 目的蛋白hu3D3/cSA的纯化和复性
• 2.8 目的蛋白hu3D3/cSA的活性分析
• 2.8.1 融合蛋白hu3D3组分的活性分析
• 2.8.2 融合蛋白cSA组分的活性分析
• 二、结果与分析
• 1 理论设计的hu3D3/cSA基因核苷酸序列
• 2 cSA基因的扩增
• 3 重组质粒hu3D3/cSA/pET-22b（+）的筛选和序列分析
• 4 目的蛋白hu3D3/cSA的表达
• 5 目的蛋白hu3D3/cSA的高效表达与纯化
• 6 蛋白浓度的测定
• 7 目的蛋白的活性鉴定
• 7.1 融合蛋白hu3D3组分的活性鉴定
• 7.2 融合蛋白cSA组分的活性鉴定
• 三、讨论
• 第二章 hu3D3/cSA介导多种药物对不同细胞株的作用
• 一、材料和方法
• 1 材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 主要试剂及耗材
• 1.3 主要仪器及设备
• 1.4 主要溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 抗肿瘤药物的选择
• 2.2 BNHS标记抗肿瘤药物
• 2.3 生物素化抗肿瘤药物的活性检测
• 2.4 体外细胞实验分析比较hu3D3/cSA联合抗肿瘤药物对不同细胞株的作用
• 2.4.1 光学显微镜观察细胞的形态结构
• 2.4.2 台盼蓝染色法描述细胞的生长曲线
• 2.4.3 MTT实验比较hu3D3/cSA联合抗肿瘤药物对不同细胞株的杀伤作用
• 二、结果与分析
• 1 抗肿瘤药物的选择
• 2 抗肿瘤药物的生物素标记与纯化
• 3 生物素化抗肿瘤药物的活性检测
• 4 hu3D3/cSA联合抗肿瘤药物对不同细胞株的体外细胞实验
• 4.1 细胞形态学观察
• 4.2 细胞生长曲线描述
• 4.3 MTT实验
• 4.3.1 各实验组对靶细胞A549的杀伤作用
• 4.3.2 各实验组对非靶细胞MGC-803的杀伤作用
• 三、讨论
• 本文存在的问题及今后应深入开展的研究
• 总结
• 参考文献
• 致谢