egfp在集胞藻6803中克隆及其表达调控研究

论文摘要

自1968年蓝藻被证实具有遗传重组现象开始,越来越多的人致力于蓝藻基因工程研究。随着蓝藻基因工程的发展,有一批外源基因被导入到蓝藻中表达。主要涉及环境治理、代谢调控、营养保健品和基因工程药物表达等应用领域。但是,外源基因表达效率低下的瓶颈制约了蓝藻基因工程的发展,无法实现规模化生产应用。影响基因表达的因素有很多。如:基因拷贝数、密码子偏好性、启动子、终止子、反义RNA技术以及蛋白表达策略等。本研究试图从选择启动子、改变SD序列入手,对改进蓝藻外源基因表达系统和提高外源基因表达效率做一些探讨。集胞藻6803（Synechocystis sp. strain PCC6803）是一种单细胞蓝藻,具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等的特点,在特殊培养条件下还可以进行异养生长,非常适合于利用光合生物反应器大规模生产。因此,集胞藻6803是种很好的蓝藻基因工程受体。本研究选择集胞藻6803染色体DNA中cupA基因及其下游相连的两个片段分别作为上游整合平台（up）和下游整合平台（down）,在二者间插入诱导型高效启动子、egfp（增强型绿色荧光蛋白基因）报告基因、卡那霉素抗性筛选标记,构建得到集胞藻6803同源重组双交换整合平台。在整合平台的基础上,通过更换启动子和进行SD序列距离修饰,共得到6个带启动子和1个不带启动子的转化载体。把转化载体分别自然转化到野生型集胞藻6803中,经卡那霉素筛选得到7个转基因藻。它们分别含有能够被红光诱导的Pcpcβ（转pK-Pcpcβ集胞藻6803和转pK-Pcpcβ2集胞藻6803）、被温度诱导的PgroESL（转pK-PgroESL集胞藻6803和转pK-PgroESL2集胞藻6803）、被光照诱导的PpsbA（转pK-PpsbA集胞藻6803和转pK-PpsbA2集胞藻6803）和1个不带启动子的转pK-P0集胞藻6803。根据启动子的不同诱导特性,分别设计梯度诱导条件诱导EGFP表达,通过检测EGFP（增强型绿色荧光蛋白）荧光检测分析。EGFP在488nm光激发下会辐射绿色荧光,利用激光共聚焦显微镜对藻细胞直接进行荧光活性检测。通过比较EGFP的检测结果,判断各转基因藻外源基因表达系统的表达效率。本实验主要结果或结论:1.构建得到6个带启动子的转化载体;2.构建得到1个不带启动子的转化载体;3.通过自然转化获得了7个转基因藻株;4. PgroESL具有温度诱导增强表达作用;5. SD序列修饰具有上调表达作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要符号表
• 第一章 文献综述
• 1.1 蓝藻基因工程
• 1.2 蓝藻外源基因表达效率影响因素
• 1.3 研究内容
• 1.4 研究目的及意义
• 1.5 技术路线图
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 第三章 分子克隆结果
• 3.1 含cpcβ启动子载体构建
• 3.2 含groESL 启动子载体构建
• 3.3 含psbA 启动子载体构建
• 3.4 转化载体pK-P0 构建
• 第四章 转基因藻获得
• 4.1 转pK-Pcpcβ集胞藻6803 获得
• 4.2 转pK-Pcpcβ2 集胞藻6803 获得
• 4.3 转pK-PpsbA 集胞藻6803 获得
• 4.4 转pK-PpsbA2 集胞藻6803 获得
• 4.5 转pK-PgroESL 集胞藻6803 获得
• 4.6 转pK-PgroESL2 集胞藻6803 获得
• 4.7 转pK-P0 集胞藻6803 获得
• 第五章 表达调控结果
• 5.1 含 PgroESL 转基因藻诱导表达
• 5.2 生物活性检测
• 第六章 分析与讨论
• 6.1 集胞藻6803 同源重组双交换整合平台构建
• 6.2 EGFP 在集胞藻6803 中作为报告基因蛋白的方便检测性
• 6.3 启动子（PgroESL）对EGFP表达的影响
• 6.4 SD 序列修饰对EGFP 表达的影响
• 第七章 总结与展望
• 7.1 总结
• 7.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 附件