论文摘要
疟疾是疟原虫通过媒介昆虫蚊传播的人类最为严重的寄生原虫感染性疾病。《Nature》公布的统计数据显示,世界上100多个国家为疟疾流行区,约22亿人口受到疟疾的威胁,每年有300～500万疟疾临床病例,病死人数高达110～270万。为此,2003年WHO将疟疾作为优先重点防治的感染性疾病。在中国,尽管在控制疟疾流行、减少危害程度方面取得了显著成效,但由于耐药性原虫和耐杀虫剂性蚊的普遍出现,以及近年来流动人口剧增、气候变暖和生态环境变化等因素,疫情状况依然十分严峻。据最新统计显示,2000年以来我国疟疾发病人数呈现逐年上升趋势,现有21个省（直辖市、自治区）的907个县有疟疾病例报告,受疟疾威胁人口高达5.5亿。因此,有效的疟疾疫苗和抗疟新药的研制开发已经成为当今世界迫切需要解决的重点课题,而疟原虫感染宿主机体应答的免疫学、分子生物学等综合基础研究是其重要前提。疟疾与其他大多数感染性疾病一样,需要通过免疫效应机制对其控制和消除。同时,由于过强的炎症反应引起脑疟等免疫病理损伤也是这一疾病的突出特征。关于红内期疟原虫感染的免疫机制,无论鼠疟模型和人体试验研究结果均已证实:①CD4+T细胞在抵抗红内期疟原虫感染过程中发挥至关重要的作用。在感染早期,Th1型细胞经DC分泌的IL-12诱导活化,产生以IFN-γ为主的炎症性细胞因子,遏制疟原虫的爆发性增殖;随之,由Th2型细胞辅助B细胞产生特异性抗体,能够有效地清除疟原虫,防止复发和再燃。由此表明:抗疟保护性免疫有赖于Th1和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡。②Th1/Th2型免疫应答的发生时相和效应强度明显地影响着最终的感染结局。各种数据显示,致死型脑疟等严重并发症的出现与机体过强的Th1型炎症应答密切相关。由此提示:维持前炎症细胞因子和抗炎症细胞因子之间的动态平衡,控制炎症性细胞因子产生的时间和强度对疟疾感染甚为关键。打破免疫应答之间的平衡或扰乱免疫应答的时间进程,均可能导致慢性感染或者病情加重。换言之,在决定疟疾感染最终结局方面,调控疟疾感染的免疫应答与诱导有效的抗疟免疫同样重要。然而,目前关于保护性和病理性免疫应答动态平衡的调控机制尚未阐明。CD4+T细胞亚类CD4+CD25+调节性T细胞（Tregs）是一类具有独特免疫调节功能的细胞群,体内、外试验显示,Tregs具有广泛的免疫抑制性,通过表面膜分子与其它细胞直接接触、或分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β两种方式,可抑制体内天然CD4+T和CD8+T细胞等多种细胞的活化和增殖。目前,对Tregs的研究主要集中于自身免疫性疾病、抗移植和抗肿瘤免疫等方面,而在疟疾等感染性疾病中作用的研究才刚刚起步,特别是关于Tregs对Th应答效应和Th1/Th2极化机制方面的研究尚未深入开展。有限的研究结果显示,在感染致死型伯氏疟原虫（Plasmodium.berghei NK65）或约氏疟原虫（P.yoelii17XL）之前,应用抗CD25单克隆抗体耗竭小鼠体内Tregs,可通过延缓疟原虫的增殖速率使其致死性感染得以控制。Tregs回输实验证实,P.yoelii 17XL感染能够特异性活化Tregs,介导疟原虫逃逸C57BL/6小鼠的T细胞应答。同样人体实验也表明恶性疟原虫（P.falciparum）感染诱导Tregs分化并伴有IL-10的升高。以上结果均提示,Tregs的活化是介导恶性疟原虫和致死型啮齿类疟原虫逃逸机体免疫应答的关键。另外,人们研究发现在细胞亚群分化过程中,转录因子也具有重要的调节作用。T-bet和GATA3是两种细胞内的转录因子,分别特异性地表达于Th1和Th2细胞。T-bet正调控Th1细胞的发育,GATA3正调控Th2细胞的发育,二者最终决定Th0向Th1/Th2的转化。由此可以看出在疟疾感染过程中T-bet和GATA3两种转录因子也参与了Th1/Th2的极化过程。为了解不同疟原虫感染过程中Th1/Th2应答的差异是否与Tregs的免疫调节作用具有一定的相关性,本研究选用致死型约氏疟原虫（P.yoelii 17XL,P.y17XL）、夏氏疟原虫（P.chabaudi AS,P.cAS）及其约氏+夏氏疟原虫（1:1）混合感染DBA/2和BALB/c小鼠,动态观察感染过程中Th1/Th2应答的差异、Tregs的数量变化和功能特点,并且在此基础上应用抗CD25单克隆抗体阻断技术,以期阐明Tregs在疟疾感染过程中的作用地位及其相关机制。实验方法1、实验动物及其模型构建6-8周龄、雌性DBA/2和BALB/c小鼠,经腹腔分别感染1×106P.y17XL、P.cAS和2×106P.y17XL+P.cAS（1:1）寄生的红细胞（PRBC）,构建不同的实验动物模型。2、采用双抗体夹心ELISA法检测小鼠感染疟原虫后IFN-γ和IL-4的含量无菌取出感染小鼠脾脏,制成细胞悬液并调整脾细胞终浓度为1×107/ml,24孔培养板上加入细胞悬液,500μl/孔,于37℃培养48h。350g室温离心10min,收集上清,-80℃保存,待IFN-γ和IL-4检测。用双抗体夹心ELISA法对IFN-γ和IL-4的含量进行检测,酶标仪检测450nm处OD值,应用SoftMax Pro4.3.1 LS软件分析,绘制标准品标准曲线,计算细胞因子含量（pg/ml）。3、采用RT-PCR方法检测转录因子T-bet和GATA3 mRNA的表达水平（1）PCR引物利用引物设计软件Primer5设计T-bet、GATA3和β-actin特异性引物。（2）实验方法采用TRIZOL一步法提取小鼠脾细胞总RNA,并经紫外分光光度仪检测纯度,RNAA260/A280的比值在1.8-2.0之间;PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,应用ID影像分析软件进行表达强度的分析。4、采用流式细胞分析技术检测小鼠感染疟原虫后脾Tregs及CD4+T细胞凋亡的百分比（1）无菌取小鼠脾脏,制成1×107/ml脾细胞悬液。每份样品用抗CD4-FITC单抗和抗CD25-PE单抗进行双色分析,另设阴性对照管。流式细胞仪专用染色管预先加入抗FcγⅢ/Ⅱ受体抗体2μl,取新鲜制备的1×107/ml脾细胞悬液0.1ml,再加入抗CD4-FITC单抗和抗CD25-PE单抗各0.2μg。振荡器低速混匀,冰浴放置,避光反应30min。每管加入2ml 2%的FCS,水平转头离心机300g,离心5min,弃上清,洗涤两次,静置15 min上机。（2）取binding buffer制备的1×106/ml脾细胞悬液0.1ml,加入流式细胞仪专用染色管中,每份样品设阴性对照管,另一管分别加入抗CD4-FITC单抗0.2μg,AnnexinV-PE和7AAD各5μl。25℃避光孵育15min,每管加binding buffer 400μl,上机。（3）流式细胞仪激发波长为488nm,利用FACS CELLQUEST软件获取细胞,每个样品分析10,000个细胞,以二维点阵图显示,记录Tregs及CD4+T细胞凋亡的百分比。5、采用双抗体夹心ELISA法检测小鼠感染疟原虫后脾细胞培养上清抑制性细胞因子IL-10和TGF-β的含量无菌取小鼠脾脏,制成1×107/ml脾细胞悬液。24孔培养板中加入细胞悬液,500μl/孔,于37℃培养48h。350g室温离心10min,收集上清。用双抗体夹心ELISA法对TGF-β和IL-10的含量进行检测,酶标仪检测450nm处OD值。应用SoftMax Pro4.3.1 LS软件分析,绘制标准品标准曲线,计算细胞因子含量（pg/ml）。6、采用细胞内染色方法检测小鼠感染疟原虫后分泌IL-10的Tregs数量的百分比无菌取小鼠脾脏,制成1×107/ml脾细胞悬液。于流式管中加入细胞悬液,500μl/管,37℃条件下PMA和伊屋诺霉素刺激2h后加入Golgi Stop共同培养4h,3%FCS洗涤后加入FITC-anti-CD4 and PE-anti-CD25荧光抗体,4℃孵育30min,3%FCS洗涤后加入固定透膜剂,4℃孵育20min,洗涤后加入APC-anti-IL-10（JES5-16E3）荧光抗体,4℃避光孵育30min,洗涤后上机。同时用FITC rat IgG2b作为同型对照。7、应用抗CD25单克隆抗体阻断技术,研究Tregs在约氏疟原虫感染早期相关的作用机制BALB/c小鼠分别在感染前1d和感染后1d腹腔注射1mg的抗CD25 mAb（7D4）,腹腔注射PBS小鼠作为对照组。分别于感染0d、3d和5d常规制备脾细胞悬液,流式细胞仪检测Tregs体内消除后数量及其CD4+T细胞凋亡数量变化;收集脾细胞培养上清待Tregs体内消除后IFN-γ和IL-10水平检测。实验结果1、不同疟原虫感染DBA/2和BALB/c小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平的比较P.y17XL感染的BALB/c小鼠IFN-γ水平仅在感染后第3d出现一过性有意义的升高;而DBA/2小鼠IFN-γ水平在感染后第1-3d出现有意义的升高并达峰值,随后缓慢下降,且IFN-γ产生水平明显高于相应时间点的BALB/c小鼠。P.cAS感染的DBA/2小鼠IFN-γ水平仅在感染后第3d出现有意义的升高;而BALB/c小鼠IFN-γ水平在感染后第3d出现有意义的升高,第5d达峰值,随后下降至正常水平,且IFN-γ产生水平明显高于相应时间点的DBA/2小鼠。P.y17XL+P.cAS感染BALB/c和DBA/2小鼠IFN-γ水平均于感染后第3d达峰值,随后下降,且DBA/2小鼠IFN-γ产生水平明显高于相应时间点的BALB/c小鼠。P.y17XL感染的BALB/c小鼠IL-4水平仅在感染后第3d出现有意义的升高;而DBA/2小鼠IL-4水平在感染后第5-8d升高并达峰值,此后缓慢下降,且IL-4产生水平明显高于相应时间点的BALB/c小鼠。P.cAS感染的DBA/2小鼠IL-4水平仅在感染后第5d出现一过性有意义的升高;而BALB/c小鼠IL-4水平在感染后第8-10d升高并达峰值,此后虽有回落但仍维持其高水平,且IL-4产生水平明显高于相应时间点的DBA/2小鼠。P.y17XL+P.cAS感染DBA/2和BALB/c小鼠IL-4水平于感染后第1-5d无明显变化,均于感染后第8d显著升高达峰值,并且DBA/2小鼠的IL-4水平明显高于相应时间点的BALB/c小鼠,随后DBA/2小鼠的IL-4水平缓慢下降,于感染后第15d下降至正常水平。2、不同疟原虫感染DBA/2和BALB/c小鼠脾细胞中转录因子T-bet和GATA3的表达水平及其比值.Py17XL感染的DBA/2和BALB/c小鼠于感染后第1dT-bet表达量均明显升高,GATA3表达量略有升高。DBA/2小鼠T-bet和GATA3的表达量均于感染后10d达峰值,而BALB/c小鼠于感染后3-5d无明显变化。DBA/2小鼠的T-bet/GATA3比值在感染后第3d达峰值,此后缓慢下降;而BALB/c小鼠的T-bet/GATA3比值在感染后第1d略有升高,随后迅速回落,小鼠死亡。P.cAS感染的DBA/2和BALB/c小鼠于感染后第1dT-bet表达量均明显升高,GATA3表达量略有升高。DBA/2小鼠T-bet和GATA3的表达量均于感染后5d达峰值,随后迅速回落;而BALB/c小鼠T-bet和GATA3的表达量均于感染后3-5d无明显变化,此后缓慢回落。DBA/2小鼠T-bet/GATA3比值在感染后第1-8d没有明显下降趋势,感染后第10d出现陡然下降,小鼠死亡;而BALB/c小鼠T-bet/GATA3比值在感染后第3d达峰值,于感染后第8d迅速下降至最低点,随后于感染后第12d再次达峰值,感染后第15d再次回落至正常水平。3、不同疟原虫感染DBA/2和BALB/c小鼠脾Tregs数量的比较P.y17XL感染小鼠于感染后第1d Tregs均出现有意义的升高。随后DBA/2小鼠Tregs缓慢上升,第5d达峰值,然后缓慢下降;而BALB/c小鼠Tregs数量迅速上升,第5d达峰值,并且Tregs数量明显高于相应时间点的DBA/2小鼠。P.cAS感染的BALB/c小鼠于感染后第1d Tregs出现有意义的升高,第5d达峰值后缓慢下降;而DBA/2小鼠的Tregs于感染后迅速持续升高,第10d Tregs细胞数量达峰值,且Tregs数量明显高于相应时间点的BALB/c小鼠。P.y17XL+P.cAS感染的DBA/2和BALB/c小鼠于感染后第1d Tregs均出现有意义的升高。随后DBA/2小鼠Tregs缓慢上升,第5d达峰值后缓慢下降;BALB/c小鼠Tregs数量迅速上升,感染后第8d达峰值,而且Tregs数量明显高于相应时间点的DBA/2小鼠。4、不同疟原虫感染DBA/2和BALB/c小鼠脾CD4+T细胞凋亡百分比的比较P.y17XL感染小鼠CD4+T细胞凋亡数量均于感染后第3d出现升高。随后DBA/2小鼠CD4+T细胞凋亡数量增加缓慢,而BALB/c小鼠则于感染后3d-5d迅速增加。P.cAS感染的BALB/c小鼠仅于感染后第8d CD4+T细胞凋亡数量出现升高,而DBA/2小鼠CD4+T细胞凋亡数量于感染后第5d出现升高,至感染后第8d达峰值,且CD4+T细胞凋亡数量明显高于相应时间点的BALB/c小鼠。5、不同疟原虫感染DBA/2和BALB/c小鼠脾细胞培养上清抑制性细胞因子IL-10和TGF-β含量的比较P.y17XL感染的DBA/2小鼠于感染后第5d IL-10出现升高,随后缓慢下降;而BALB/c小鼠于感染后第1-5d IL-10明显升高后达峰值,且IL-10水平明显高于相应时间点的DBA/2小鼠。P.cAS感染的BALB/c小鼠于感染后第1d IL-10就出现升高,第8d达峰值,随后缓慢下降;DBA/2小鼠IL-10水平于感染后第3d出现升高,第10d达峰值,且IL-10水平明显高于相应时间点的BALB/c小鼠。P.y17XL感染的DBA/2小鼠于感染后第10d和12d TGF-β出现升高,随后迅速下降至正常水平;而BALB/c小鼠仅于感染后第5d TGF-β出现升高。P.cAS感染的DBA/2小鼠TGF-β水平于感染5-8d升高后达峰值;而BALB/c小鼠于感染后第3d TGF-β出现一过性升高后于第8d下降至正常水平。6、Anti-CD25mAb体内阻断后,P.y17XL感染早期BALB/c小鼠免疫应答模式的变化应用anti-CD25mAb体内阻断后,BALB/c小鼠的原虫血症水平上升缓慢且峰值低,生存率明显延长,甚至部分小鼠存活;IFN-γ产生水平显著升高,IL-10产生水平明显减少,且CD4+T细胞凋亡数量也明显下降。结论1、P.y17XL和P.cAS感染过程中,小鼠DBA/2和BALB/c免疫应答存在明显差异。2、P.y17XL和P.cAS感染过程中,Th1和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡对抵抗疟疾感染至关重要,同时提示Th1和Th2型免疫应答的发生时相和效应强度可能最终影响着疟疾感染结局。3、Tregs数量的过早升高与P.y17XL感染的BALB/c小鼠Th1型免疫应答未能有效建立密切相关;4、Tregs数量的异常活化与P.cAS感染的DBA/2小鼠未能成功的从Th1向Th2型细胞免疫应答转化密切相关;5、P.y17XL+P.cAS混合感染过程中,DBA/2和BALB/c小鼠免疫应答模式与P.y17XL单独感染DBA/2和BALB/c小鼠的应答模式相同;6、P.y17XL+P.cAS混合感染过程中,Th1和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡对抵抗疟疾感染至关重要;7、Tregs数量的持续升高与P.y17XL+P.cAS混合感染的BALB/c小鼠Th1型免疫应答未能有效建立及感染结局密切相关。8、P.y17XL感染早期,Tregs是通过分泌抑制性细胞因子IL-10和诱导CD4+T细胞的凋亡来介导免疫抑制作用,参与Th1型细胞免疫应答的调节。
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