玉米ZmWRKY44和ZmWRKY50基因与非生物胁迫相关的功能初探

论文摘要

玉米在生长过程中受到病虫害、干旱、盐害、冷害、高温等多种不良的外界环境的影响,从而抑制其生长发育,降低产量。应用现代分子生物学技术,挖掘重要的抗逆基因并将其进行遗传转化,不失为得到耐逆性强的玉米品种以及提高玉米产量的有效方法之一。对胁迫相关的基因进行功能研究是开发利用这些基因的前提。WRKY转录因子在植物的非生物胁迫应答过程中发挥了重要的调控作用。WRKY具有高度保守的WRKY结构域,通过与靶基因启动子中的W-box特异结合调控其表达。WRKY转录因子能够参与多种不同的信号途径,功能具有多样性。因此,WRKY基因及其调控的靶基因都是潜在的重要抗逆基因。本实验主要对两个玉米WRKY转录调控因子ZmWRKY50和ZmWRKY44的非生物胁迫相关功能进行初探。以玉米自交系178为材料,分别克隆了ZmWRKY50和ZmWRKY44基因。首先对ZmWRKY50和ZmWRKY44的cDNA序列讲行系统讲化树分析。其次通过RT-qPCR分析了ZmWRKY44在盐害和干旱等非生物胁迫条件下的表达模式。同时构建过量表达载体pCBP-ZmWRKY50和pCBP-ZmWRKY44,通过农杆菌转化将其转入野生型拟南芥中,得到转基因植株,并对纯合阳性35S::ZmWRKY44植株进行耐盐性表型分析。此外,构建了pCHF3-ZmWRKY50-GFP和pCHF3-ZmWRKY44-GFP瞬时表达载体进行亚细胞定位,以及pGBKT7-ZmWRKY50和pGBKT7-ZmWRKY44载体进行酵母转录激活实验,验证二者的转录激活功能。主要研究结果如下：1、系统进化树分析结果表明ZmWRKY50与水稻OsWRKY68同源性最高；ZmWRKY44与小麦TaWRKY25.大麦HvWRKY31同源性最高,说明ZmWRKY50和ZmWRKY44的功能可能分别类似于其同源基因的功能。2、ZmWRKY44基因的RT-qPCR分析结果表明,ZmWRKY44的表达受到盐害、高温、H202等非生物条件以及ABA激素的抑制,证明ZmWRKY44可能作为负调控因子参与植物的盐害、高温等非生物胁迫以及ABA信号转导途径。3、通过农杆菌介导法分别将过量表达载体pCBP-ZmWRKY50和pCBP-ZmWRKY44转化到拟南芥中,经过Basta筛选、PCR检测及基因测序得到纯合阳性转基因植株。4、对纯合的拟南芥35S::ZmWRKY44植株进行耐盐性表型分析,35S::ZmWRKY44植株对盐胁迫表现出一定的敏感性,证明ZmWRKY44的过量表达降低植物的耐盐性,作为植物盐胁迫应答的负调控因子。5、农杆菌注射渗透法转化烟草瞬时表达结果显示,ZmWRKY50和ZmWRKY44蛋白都定位于细胞核中,并具有转录调控作用。6、酵母转录激活实验证明ZmWRKY50和ZmWRKY44蛋白都具有转录激活功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 WRKY转录因子与植物的胁迫
• 1.2 WRKY的结构及分类
• 1.3 WRKY蛋白结合W-BOX的机制
• 1.4 WRKY参与植物对生物胁迫的调控
• 1.5 WRKY参与植物对非生物胁迫的调控
• 1.5.1 WRKY转录因子与干旱和盐害
• 1.5.2 WRKY转录因子与温度胁迫
• 1.5.3 WRKY转录因子与矿质元素胁迫
• 1.5.4 WRKY转录因子与其它非生物胁迫
• 1.6 WRKY调控植物的物质代谢和生长发育
• 1.6.1 WRKY与植物的物质代谢
• 1.6.2 WRKY与植物形态建成
• 1.6.3 WRKY与种子萌发和种子发育
• 1.6.4 WRKY与植物衰老
• 1.7 立题依据
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 主要试剂与仪器
• 2.1.4 培养基种类及配制
• 2.1.4.1 拟南芥转化所用培养基
• 2.1.4.2 玉米基本培养液
• 2.1.4.3 细菌培养基
• 2.1.4.4 酵母培养基
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 ZmWRKY50和ZmWRKY44基因序列的获得与克隆
• 2.2.2 物种间WRKY进化树的构建
• 2.2.3 ZmWRKY44基因在非生物胁迫下的表达分析
• 2.2.3.1 玉米自交系材料的不同非生物胁迫处理
• 2.2.3.2 玉米总RNA的提取
• 2.2.3.3 RNA样品中的DNA去除和RNA的反转录
• 2.2.3.4 ZmWRKY44基因的时空表达模式分析
• 2.2.4 ZmWRKY50和ZmWRKY44蛋白的亚细胞定位
• 2.2.4.1 ZmWRKY50和ZmWRKY44瞬时表达表达载体的构建
• 2.2.4.2 农杆菌注射渗透法转化烟草瞬时表达
• 2.2.4.3 共聚焦荧光显微镜检测
• 2.2.5 ZmWRKY50和ZmWRKY4的转录激活功能验证
• 2.2.5.1 pGBKT7-ZmWRKY50和pGBKT7-ZmWRKY44载体的构建
• 2.2.5.2 ZmWRKY50和ZmWRKY44的转录激活功能验证
• 2.2.6 ZmWRKY50和ZmWRKY44基因的遗传转化研究
• 2.2.6.1 pCBP-ZmWRKY50和pCBP-ZmWRKY44过量表达载体的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 ZMWRKYSO和ZMWRKY44基因的克隆
• 3.2 ZMWRKY50和ZMWRKY44的结构及系统进化树分析
• 3.3 ZMWRKY44基因在非生物胁迫下的表达分析
• 3.3.1 不同样品的RNA提取和CDNA的合成
• 3.3.2 标准曲线的制作与溶解曲线
• 3.3.3 逆境胁迫条件下ZmWRKY44基因的表达情况
• 3.3.3.1 盐胁迫条件下ZmWRKY44基因的表达情况
• 3.3.3.2 高温胁迫条件下ZmWRKY44基因的表达情况
• 2O₂条件下ZmWRKY44基因的表达情况'>3.3.3.3 20 %的H₂O₂条件下ZmWRKY44基因的表达情况
• 3.3.3.4 脱落酸（ABA）处理条件下ZmWRKY44基因的表达情况
• 3.3.3.5 PEG6000处理条件下ZmWRKY44基因的表达情况
• 3.4 ZMWRKY50和ZMWRKY44蛋白的亚细胞定位
• 3.4.1 ZmWRKY50和ZmWRKY44瞬时表达载体的构建
• 3.4.2 ZmWRKY50和ZmWRKY44在烟草叶片中的亚细胞定位
• 3.5 ZMWRKY50和ZMWRKY44的转录激活功能验证
• 3.5.1 pGBKT7-ZmWRKY50和pGBKT7-ZmWRKY44载体的构建
• 3.5.2 ZmWRKY50和ZmWRKY44的转录激活功能验证
• 3.6 ZMWRKY50和ZMWRKY44基因的遗传学功能研究
• 3.6.1 pCBP-ZmWRKY50和pCBP-ZmWRKY44过量表达载体的构建
• 3.6.2 pCBP-ZmWRKY50和pCBP-ZmWRKY44过量表达载体对拟南芥的转化
• 3.6.2.1 pCBP-ZmWRKY50和pCBP-ZmWRKY44过量表达载体转化农杆菌
• 3.6.2.2 农杆菌介导的拟南芥花序转化以及转基因植株的分子检测
• 3.6.3 35S：：ZmWRKY44拟南芥植株的耐盐性分析
• 3.6.3.1 ZmWRKY44高效表达转基因植株的筛选
• 3.6.3.2 盐胁迫对35S：：ZmWRKY44种子发芽率的影响
• 3.6.3.3 盐胁迫对35S：：ZmWRKY44植株生长的影响
• 3.6.4 35S：：ZmWRKY44拟南芥植株中的耐逆基因表达特性分析
• 3.6.4.1 标准曲线的制作与溶解曲线
• 3.6.4.2 35S：：ZmWRKY44拟南芥植株中的耐逆基因表达特性分析
• 4 结果讨论
• 4.1 ZMWRKY50和ZMWRKY44的进化关系
• 4.2 ZMWRKY50和ZMWRKY44的亚细胞定位以及酵母转录激活
• 4.3 ZMWRKY44基因对非生物逆境的调控
• 4.3.1 干旱胁迫对ZmWRKY44基因表达的影响
• 4.3.2 高温胁迫对ZmWRKY44基因表达的影响
• 2O₂对ZmWRKY44基因表达的影响'>4.3.3 H₂O₂对ZmWRKY44基因表达的影响
• 4.3.4 ZmWRKY44对植物盐胁迫的调控
• 4.3.4.1 盐胁迫对355：：ZmWRKY44植株表型的影响
• 4.3.4.2 ZmWRKY44负调控盐胁迫途径的分子机制
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢