大白菜推定AP2/ERF转录因子cDNA的分离及表达载体的构建

论文摘要

AP2族转录因子在植物适应逆境的过程中起着重要的调节作用并具有明显的功能多样性。为了开展AP2族转录因子在大白菜高温胁迫中的功能分析,本研究利用高温诱导处理的大白菜叶片所构建的cDNA文库,在优化cDNA文库筛选方法的基础上,筛选出一个推定AP2/ERF转录因子的全长cDNA,并利用Gateway技术构建入门载体和表达载体,主要结果如下：1、采用基于PCR技术的96孔板cDNA文库筛选法,利用大白菜与AP2/ERF蛋白同源的EST进行拼接并设计的引物,筛选cDNA文库获得了一个推定AP2/ERF转录因子的阳性cDNA克隆。测序结果表明,该cDNA阳性克隆长度为812bp,含有一个172个氨基酸的开放读码框架,与拟南芥等其它植物的AP2族蛋白有较高的同源性,推测它可能与大白菜适应热胁迫有关。2、利用Gateway大规模克隆技术分别构建了上述大白菜推定AP2/ERF转录因子入门载体和表达载体,该载体可应用于农杆菌的双子叶植物转化,为该基因功能的分析研究奠定了基础。本研究为进一步开展AP2族转录因子在大白菜热胁迫响应中的功能分析研究奠定了重要的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 高温诱导的防御反应
• 1.1 高温对大白菜的伤害
• 1.2 大白菜响应热胁迫及它的防御反应
• 2 转录因子的研究进展
• 3 cDNA文库的筛选方法
• 3.1 核酸杂交探针筛选法
• 3.2 DNA芯片技术
• 3.3 基于96孔板的PCR筛选法
• 第二章 大白菜推定AP2/ERF转录因子CDNA分离
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 AP2转录因子同源EST搜索、拼接以及AP2特异性引物的设计及合成
• 1.2.2 CCAP2/ERF特异性引物与文库测序引物
• 1.2.3 96孔板法筛选文库
• 2 结果与分析
• 2.1 目标cDNA PCR扩增的模板最大稀释倍数的确定
• 2.2 基于PCR的96孔板cDNA文库的筛选
• 2.2.1 第一轮PCR电泳结果
• 2.2.2 第二轮PCR电泳结果
• 2.2.3 第三轮PCR电泳结果
• 2.3 阳性克隆的获得
• 2.4 阳性克隆的测序以及同源性比较
• 2.5 推导氨基酸序列的分析
• 2.6 大白菜CCAP2/ERF1基因的结构分析及功能预测
• 3 讨论
• 3.1 筛选特定基因cDNA克隆的cDNA文库构建
• 3.2 关于引物的设计
• 3.3 关于96孔板文库的筛选
• 3.4 关于CCAP2/ERF1转录因子在大白菜中的功能
• 3.5 cDNA文库筛选方法
• 3.6 筛选过程中应注意的问题
• 3.7 关于大白菜AP2转录因子的cDNA阳性克隆
• 第三章 利用GATEWAY通用型克隆系统构建表达载体
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 质粒
• 1.1.2 菌株
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 质粒制备
• 1.2.2 构建策略
• 1.2.3.表达载体对农杆菌的转化
• 1.2.4 农杆菌保存
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR扩增attB-PCR产物结果
• 2.2 入门载体pENTR207-CCAP2/ERF的PCR验证
• 2.3 表达载体pMDC83-CCAP2/ERF1的PCR验证
• 2.3.1 pMDC83和入门载体的电泳检测
• 2.3.2 LR反应结果
• 2.4 验证表达载体对农杆菌的转化
• 3 讨论
• 3.1 关于BP,LR反应注意事项
• 3.2 Gateway克隆技术适用于大规模基因的克隆
• 3.3 关于CCAP2/ERF1基因农杆菌介导的遗传转化结果的探讨
• 小结
• 参考文献
• 附录1 缩略词及英汉对照
• 附录2 主要仪器与主要试剂
• 附录3 所用试剂与缓冲液的配制
• 附录4 本研究中所用的DNA Marker
• 致谢