短柄草磷转运蛋白基因的克隆与功能分析

论文摘要

磷是植物体内核酸、磷脂和ATP的重要组成成分,同时也是植物生长发育重要的营养元素,作为植物体内能量转移的物质,磷在活化体内蛋白质、调控植物体代谢过程、调节植株生长和抗逆性等方面发挥重要作用。通常土壤中能为植物吸收的有效磷并不高,不能有效满足植物生长发育的需要。磷转运蛋白在植物磷的吸收中起着重要作用,尤其是Pht1家族基因,大多为高亲和力磷转运蛋白,受低磷调控并且主要在根部表达。本研究利用信息生物学的手段,预测出短柄草中磷转运蛋白基因,结合同源克隆的方法得到gDNA和cDNA的序列,预测出短柄草中Pht1基因家族的成员,并运用荧光定量的方法对Pht1基因家族成员进行组织特异性表达和低磷诱导表达,对部分基因构建拟南芥和酵母表达载体,进行功能验证。具体结果如下:1.借助生物信息学的方法,对短柄草的基因组进行分析,推测可能的磷转运蛋白基因18个,依据其在染色体上的位置,分别命名为Bd1g00700,Bd1g42610,Bd1g52590,Bd1g67330,Bd1g75020,Bd1g75030,Bd1g76010,Bd2g10810, Bd2g45520, Bd3g12590, Bd3g27680, Bd3g47550, Bd3g57890, Bd4g32020, Bd5g02730, Bd5g02760, Bd5g02770,Bd5g11740。通过同源克隆的方法得到这18个基因的gDNA和cDNA的序列。?2.对克隆到的基因所编码氨基酸的进行生物信息学分析,预测得到12基因个可能属于Pht1家族,分别命名为BRAdi;Pht1;1- BRAdi;Pht1;12,对这些蛋白进行跨膜结构分析,都具有Pht1家族的典型结构,进一步确定其属于Pht1家族成员。3.对短柄草Pht1家族成员氨基酸序列进行同源性分析,发现12个基因之间有很高的相似性,都具有Pht1基因家族的特征序列GGDYPLSATIMSEYA,与水稻、大麦、拟南芥中的Pht1基因构建系统发育进化树,进化树分析将这12个同源基因分为不同的亚组,这些同源基因与大麦的同源性较高,其次是水稻,而与拟南芥的同源性最低。4.利用荧光定量PCR方法对Pht1家族基因进行组织特异性表达分析,这些基因在不同的组织中表达量不同,大部分基因在种子中的表达量最高,其中BdPht1;6、BdPht1;8、BdPht1;9和BdPht1;12等4个基因在苗期根中的表达显著高于叶片。用不同磷浓度的营养液处理短柄草,取根部材料,对Pht1家族基因进行荧光定量PCR,BdPht1;6（1g76010）对低磷处理有响应,在缺磷时的表达量为对照的20倍,随着磷浓度的提高,表达量逐渐降低。6.对基因Bd1g67330,Bd1g76010,Bd4g32020构建到拟南芥表达载体P1300和酵母缺磷突变体MB192载体P112A1NE中,进行拟南芥转基因和酵母功能互补实验,验证所克隆到的基因功能,结果尚未完成,有待于进一步的实验。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1. 文献综述
• 1.1 新型禾本科模式作物短柄草
• 1.2 短柄草的研究进展
• 1.2.1 短柄草生物学特性研究
• 1.2.2 短柄草的分类地位
• 1.2.3 短柄草的遗传学研究
• 1.2.4 短柄草的分子生物学研究
• 1.2.5 二穗短柄草
• 1.3 植物的磷素营养及现状
• 1.3.1 磷元素在植物生长发育和新陈代谢中的作用
• 1.3.2 土壤磷的利用与现状
• 1.3.3 磷肥的使用与影响
• 1.4 植物对低磷胁迫的响应
• 1.4.1 低磷胁迫对植物代谢的影响
• 1.4.2 植物对低磷胁迫的响应
• 1.4.2.1 根系形态的变化
• 1.4.2.2 生理生化的变化
• 1.5 磷转运蛋白的研究现状
• 1.5.1 磷转运蛋白编码基因的研究进展
• 1.5.2 磷转运蛋白基因的结构特征
• 1.5.3 磷转运蛋白基因的组织差异性表达
• 1.5.4 植物磷转运蛋白基因的功能鉴定
• 1.5.4.1 突变体互补分析
• 1.5.4.2 转基因表达分析
• 2. 引言
• 3. 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 实验试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 基因克隆
• 3.2.1.1 序列获取与引物设计
• 3.2.1.2 Bd21 总 DNA 的提取
• 3.2.1.3 总 RNA 的提取与纯化
• 3.2.1.4 cDNA 第一链的合成
• 3.2.1.5 PCR 扩增
• 3.2.1.6 PCR 产物的回收、连接和转化
• 3.2.1.7 重组克隆的筛选
• 3.2.1.8 DNA 测序
• 3.2.1.9 质粒提取
• 3.2.2 拟南芥转化
• 3.2.2.1 载体构建
• 3.2.2.2 农杆菌感受态的制备
• 3.2.2.3 农杆菌的转化
• 3.2.2.4 拟南芥植株的转化
• 3.2.2.5 GUS 活性检测
• 3.2.3 酵母互补功能验证
• 3.2.3.1 载体构建
• 3.2.4. 组织特异性表达
• 4 结果与分析
• 4.1 磷转运蛋白基因的克隆与序列分析
• 4.1.1 短柄草中磷转运蛋白的基因预测
• 4.1.2 短柄草中磷转运蛋白基因的克隆
• 4.2 基因结构预测与 Pht1 家族成员的确定
• 4.3 Pht1 编码氨基酸序列的生物信息学分析
• 4.3.2 Pht1 家族基因同源性分析
• 4.3.3 进化树分析
• 4.4 组织特异性表达
• 4.5 低磷处理表达
• 5. 结论与讨论
• 5.1 磷转运蛋白基因克隆
• 5.2 Pht1 家族生物信息学分析
• 5.3 Pht1 家族组织特异性表达与低磷处理表达
• 5.5 基因功能验证
• 参考文献
• ABSTRACT