第三代生物柴油的开发研究

论文摘要

生物柴油是一种重要的可再生能源,其生产方法是将原料油脂和短链醇在催化剂的催化下,转化合成生物柴油（如脂肪酸甲酯/脂肪酸乙酯）。生物柴油已在各国广泛生产和应用,2008年全球生物柴油产量已达到1400万吨,近几年生物柴油产量正以较快的速度增长。目前,原料成本高、生产工艺较复杂是生物柴油生产工艺中主要问题。因此,如何利用微生物直接发酵生产生物柴油,建立一种高效的、可替代石化柴油和现有生物柴油生产的新技术、新路线显得日益迫切。本论文分别从长链生物柴油基因工程菌的构建及发酵条件优化,中链脂肪酸乙酯的合成、中链脂肪酸及其乙酯基因工程菌的构建等方面进行了研究。1.构建了产长链生物柴油的酿酒酵母基因工程菌。通过重组质粒的构建、转化和重组子筛选,导入质粒YEp352-PLC的重组酿酒酵母表达了大小约为42KDa的重组蛋白,脂肪酶的比活力为12.12U/mg,胞内油脂中长链脂肪酸含量超过92%。发酵培养96h,提取的重组酿酒酵母油脂中脂肪酸乙酯产量约为3.7mg/g （DCW）。2.为了提高重组酿酒酵母脂肪酸乙酯产量,利用响应面法优化了酿酒酵母产油脂发酵条件。在优化的发酵条件下,重组酿酒酵母油脂产量比对照提高了2倍左右,达到14.55%。3.通过均匀设计优化了酿酒酵母联产油脂和乙醇的发酵条件。考察了通气量、搅拌速率和葡萄糖流加对酿酒酵母产油脂和乙醇的影响,通过非线性拟合得到两个相关性在90%的方程。分析表明,搅拌速率对酿酒酵母产油脂和乙醇的影响大于其它两个因素。通过计算得到产油脂、产乙醇、联产油脂和乙醇的最优条件,并得以实验验证。4.优化了酿酒酵母工程菌产脂肪酸乙酯的发酵条件。在酿酒酵母产油脂发酵条件的基础上,3次添加反应体系体积4%的乙醇效果最佳,所得到的FAEEs量达到11.4mg/g （DCW）。5.开发了利用樟树籽油合成中链生物柴油的合成工艺。首先利用正交实验优化了微波辅助萃取法提取樟树籽油的提取条件,油脂提取率达到90%以上,樟树籽油中脂肪酸组成以癸酸（53.4%）和月桂酸（38.7%）为主,中链脂肪酸含量占脂肪酸总含量的94%。其次采用固定化脂肪酶Candida sp.99-125催化樟树籽油合成生物柴油（脂肪酸乙酯）,优化后的合成工艺条件为：水含量10%（wt）,酶用量15%（wt）,油／醇摩尔比1：3.2,9次流加乙醇（间隔时间2.67h）,反应温度40-C,摇床转速170rpm,反应24h,脂肪酸乙酯产率达93.5%。6.构建了产中链脂肪酸的基因工程菌。克隆樟树硫酯酶基因ccFatB并转入大肠杆菌表达。重组大肠杆菌发酵培养产物中,肉豆蔻酸产量为52mg/L,占总脂肪酸含量的10.6%。7.构建了产中链生物柴油的基因工程菌。克隆不动杆菌酰基转移基因atfA和ccFatB,构建了双基因表达载体pETDuet-ccFatB-atfA,转入大肠杆菌表达。基因工程菌利用外源流加4%的乙醇在胞内合成脂肪酸乙酯,肉豆蔻酸乙酯产量约为2.1mg/L,占乙酯总量的10%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 生物柴油概述
• 1.1.1 生物柴油主要理化性质
• 1.1.2 生物柴油的制备方法
• 1.1.3 生物柴油发展历程
• 1.2 真核生物油脂的代谢机理
• 1.2.1 产油微生物及微生物油脂
• 1.2.2 微生物产油脂培养条件优化方法
• 1.2.3 真核生物油脂代谢调控机理
• 1.3 原核生物油脂代谢调控
• 1.3.1 原核细胞的油脂代谢
• 1.3.2 原核细胞的油脂代谢工程
• 1.4 中链脂肪酸及其乙酯
• 1.4.1 中链脂肪酸
• 1.4.2 中链脂肪酸合成涉及的酶类
• 1.4.3 中链脂肪酸乙酯
• 1.5 论文研究目的与研究内容
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 产长链生物柴油基因工程菌的构建
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 工具酶和试剂
• 2.2.3 培养基及培养条件
• 2.3 实验仪器
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 酿酒酵母基因组DNA的提取
• 2.4.2 假丝酵母基因组DNA的提取
• 2.4.3 基因的扩增
• 2.4.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.5 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
• 2.4.6 扩增基因与测序载体的连接
• 2.4.7 重组质粒的电转化
• 2.4.8 阳性克隆的筛选
• 2.4.9 目的基因片段的验证和序列分析
• 2.4.10 重叠延伸PCR
• 2.4.11 目的基因与表达载体的连接
• 2.4.12 酿酒酵母感受态细胞的制备
• 2.4.13 重组质粒的转化
• 2.4.14 重组酿酒酵母的筛选
• 2.4.15 表达蛋白的SDS-PAGE分析
• 2.4.16 脂肪酶活性测定
• 2.4.17 脂肪酸组成的测定
• 2.4.18 FAEEs的分析方法
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 酿酒酵母基因组DNA提取
• 2.5.2 基因片段的扩增
• 2.5.3 测序载体的构建
• 2.5.4 基因测序结果分析
• 2.5.5 重组质粒pYES2-Lip2的鉴定
• 2.5.6 重组质粒YEp352-PLC的鉴定
• 2.5.7 重组蛋白的SDS-PAGE分析
• 2.5.8 重组酵母的生长与脂肪酶酶活变化
• 2.5.9 酿酒酵母油脂成分分析
• 2.5.10 重组酵母菌中FAEEs含量的测定
• 2.6 本章小结
• 第三章 酿酒酵母基因工程菌产生物柴油条件的优化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 培养基及发酵培养条件
• 3.3 实验仪器
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 油脂提取方法
• 3.4.2 乙醇测定方法
• 3.4.3 重组酵母细胞催化酯化反应
• 3.4.4 重组酵母细胞的发酵培养
• 3.4.5 GC-MS测定脂肪酸乙酯含量
• 3.4.6 响应面法
• 3.4.7 均匀设计法
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 产油脂发酵条件的优化
• 3.5.1.1 影响酵母产油脂的单因素试验
• 3.5.1.2 影响酵母产油脂主要因素的筛选
• 3.5.1.3 最陡爬坡试验设计及结果
• 3.5.1.4 响应面设计优化产油脂发酵条件
• 3.5.2 酿酒酵母联产油脂和乙醇的发酵条件优化
• 3.5.2.1 均匀设计实验结果
• 3.5.2.2 葡萄糖流加、通气量、搅拌转速对油脂产量的影响
• 3.5.2.3 葡萄糖流加、通气量、搅拌转速对乙醇产量的影响
• 3.5.2.4 产油脂与乙醇关系的分析
• 3.5.2.5 产油脂和乙醇最优条件的验证
• 3.5.3 酿酒酵母产FAEEs的条件优化
• 3.5.3.1 以酿酒酵母细胞粉末为催化剂合成生物柴油
• 3.5.3.2 细胞粉末用量对FAEEs产量的影响
• 3.5.3.3 重组酿酒酵母胞内直接合成生物柴油的优化
• 3.6 本章小结
• 第四章 中链脂肪酸乙酯的合成
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 实验原料
• 4.2.2 实验试剂及仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 微波萃取法
• 4.3.2 樟树籽油脂肪酸组成分析
• 4.3.3 酶法合成脂肪酸乙酯反应条件
• 4.3.4 FAEEs产率测定
• 4.3.5 FAEEs主要理化性质测定
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 CSO提取条件的优化
• 4.4.1.1 正交试验
• 4.4.1.2 验证试验及多次提取
• 4.4.2 CSO成分分析
• 4.4.3 脂肪酶用量对FAEEs产率的影响
• 4.4.4 水含量对FAEEs产率的影响
• 4.4.5 油醇摩尔比对FAEEs产率的影响
• 4.4.6 乙醇流加次数对FAEEs产率的影响
• 4.4.7 mcFAEEs合成条件的优化
• 4.4.8 固定化脂肪酶的使用寿命
• 4.4.9 FAEEs的主要理化性质
• 4.5 本章小结
• 第五章 中链脂肪酸及其乙酯基因工程菌的构建
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 菌株与质粒
• 5.2.2 工具酶和试剂
• 5.2.3 培养基及培养条件
• 5.3 仪器设备
• 5.4 实验方法
• 5.4.1 ccFatB的克隆
• 5.4.2 不动杆菌基因组DNA的提取
• 5.4.3 酰基转移酶基因atfA的克隆
• 5.4.4 重组载体pETDuet-ccFatB的构建
• 5.4.5 双基因重组载体pETDuet-ccFatB-atfA的构建
• 5.4.6 重组质粒的转化
• 5.4.7 重组菌的发酵培养与脂肪酸的提取
• 5.4.8 重组菌的发酵培养与产物FAEEs的提取
• 5.4.9 GC-MS分析
• 5.5 结果与讨论
• 5.5.1 ccFatB序列的优化
• 5.5.2 樟树硫酯酶基因的克隆
• 5.5.3 不动杆菌中酰基转移酶基因的克隆
• 5.5.4 重组质粒pETDuet-ccFatB的构建
• 5.5.5 重组质粒pETDuet-ccFatB-atfA的构建
• 5.5.6 重组E.coli所产脂肪酸组分分析
• 5.5.7 重组E.coli中FAEEs的分析
• 5.5.8 乙醇流加对重组菌产脂肪酸及FAEEs的影响
• 5.6 本章小结
• 第六章 结论与创新点
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 6.3 问题和展望
• 参考文献
• 研究成果及发表的学术论文
• 致谢
• 作者和导师简介
• 附件