荧光标记对B-16细胞形态及生物学行为的影响

论文摘要

背景:转移和侵袭是恶性肿瘤的显著特征,也是临床治疗失败和患者死亡的主要原因。治愈肿瘤的关键是去除机体内的肿瘤组织,并预防其复发和转移。肿瘤转移机制是癌症研究的最热点问题之一,在体内、外研究中也取得了很多成果,但是对肿瘤转移的早期事件由于缺乏有效的研究手段还有许多问题没有解决。在体内还很难实时地捕捉、记录到单个肿瘤细胞增殖至多个肿瘤细胞的克隆过程,其难点是在体内无法区分正常细胞和肿瘤细胞。近年来应用荧光染料或荧光蛋白基因标记肿瘤细胞,利用荧光显微镜在体内、外实时观察肿瘤细胞浸润、增殖和转移的研究散见报告,但是肿瘤细胞经过荧光染色或荧光蛋白基因的导入,在体外对肿瘤细胞的形态,增殖、侵袭和粘附能力等是否有显著影响,以及经过标记的肿瘤细胞在体内毛细血管网内的状态,粘附、增殖情况还没有进一步的研究。目的:观察体外荧光标记对B-16细胞形态、增殖、粘附和侵袭的影响,以及经过标记的B-16细胞在体内毛细血管网中的粘附、增殖情况。方法:pEGFP-N3表达质粒转染鼠恶性黑色素瘤细胞株B16,建立稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）基因的恶性黑色素瘤细胞株B16/EGFP,荧光染料CMFDA标记鼠恶性黑色素瘤细胞株B16/CMFDA。分组:B16细胞为对照组（ A组）,荧光染料CMFDA标记的恶性黑色素瘤细胞为B16/CMFDA组（B组）,绿色荧光蛋白标记的恶性黑色素瘤细胞为B16/EGFP组（C组）。倒置相差显微镜下观察对照组、B16/CMFDA组和B16/EGFP组细胞贴壁状态和细胞形态。细胞记数法测定对照组、B16/CMFDA组和B16/EGFP组的细胞增殖曲线。MTT微量酶反应比色法测定对照组、B16/CMFDA组和B16/EGFP组的粘附率;transwell小室检测对照组、B16/CMFDA组和B16/EGFP组的细胞侵袭力。C57鼠尾静脉注入荧光标记的B16细胞（B、C组）,观察B16细胞在体内毛细血管网中的粘附、增殖。结果:倒置相差显微镜下观察,在体外培养时无论是pEGFP-N3表达质粒转染的B16/EGFP细胞株还是荧光染料CMFDA标记的B16/CMFDA细胞的贴壁状态、形态无显著变化。细胞培养至第7天,B16组第1-7天细胞数（×104）分别为5、12、25、70、220、510、810。B16/CMFDA组第1-7天细胞数分别为5、11.5、27、80、210、510、880。B16/EGFP组第1-7天细胞数分别为5、12.1、25.5、71、210、500、830。各组细胞生长曲线基本重叠,各组细胞均在接种的第3天进入对数生长期,第7天细胞长满25cm2培养瓶。统计学分析表明B16细胞组、B16/CMFDA细胞组、B16/EGFP细胞组的增殖曲线无明显差（P>0.05）。37℃、5% CO2培养60分钟,B16组、B16/CMFDA组、B16/EGFP组的OD值分别为0.269±0.029,0.303±0.027,0.319±0.06。与对照组比较B16/CMFDA组、B16/EGFP组的粘附率分别为3.4%、5.0%。统计学分析B16组、B16/CMFDA组、B16/EGFP组粘附率无显著性差异（P>0.05）。37℃、5% CO2培养48小时,B16组、B16/CMFDA组、B16/EGFP组穿透滤膜的细胞数分别为85.33±7.57、61.33±17.56、73.67±25.32。统计学分析B16组、B16/CMFDA组、B16/EGFP组穿膜的细胞数无显著性差异（P>0.05）。结论:荧光染料CMFDA标记B16细胞和绿色荧光蛋白（GFP）基因转染B16细胞,对细胞的贴壁状态、形态、增殖、粘附和侵袭无显著影响;荧光标记的B16细胞在体内能够正常的增殖,与毛细血管内皮细胞粘附,侵袭细胞外基质,在肺内形成转移灶;因此利用荧光标记肿瘤细胞,可以为研究肿瘤侵袭和转移的发生机制提供一种研究手段和方法,特别是对肿瘤转移早期事件相关的研究提供一个从形态学,组织学到细胞生物学以及分子生物学水平研究的共用平台。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料与方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢