无机焦磷酸化酶基因遗传转化甘蔗的研究

论文摘要

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是我国最为重要的糖料作物,也是一种重要的能源作物,提高甘蔗的含糖量是甘蔗育种的主要目标,提高甘蔗蔗糖合成的能力可以有效的提高甘蔗的含糖量。甘蔗中蔗糖的合成是在叶肉细胞中进行的,其合成过程中会产生大量的焦磷酸,而焦磷酸在叶肉细胞中大量的积累不利于蔗糖的合成。焦磷酸可被无机焦磷酸化酶分解,因此,将无机焦磷酸化酶基因导入甘蔗中使其在叶肉细胞中有效的表达,将有利于蔗糖的合成,进而提高甘蔗的蔗糖含量。本研究根据面包酵母无机焦磷酸化酶(PPase)基因的序列设计并合成特异引物,从面包酵母中克隆到PPase基因,再利用水稻叶肉细胞特异表达启动子rbcS构建其植物表达载体pCBIPR,并利用“冻融法”导入超毒性农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法对甘蔗进行遗传转化,经过PPT抗性筛选,获得抗性植株56株。对其中的9株进行PCR检测,有2株呈阳性,初步证明无机焦磷酸化酶基因已整合到甘蔗的基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 甘蔗的概况
• 1.1.1 甘蔗的重要性
• 1.1.2 甘蔗育种现状
• 1.2 甘蔗蔗糖代谢的研究
• 1.2.1 蔗糖合成部位和途径
• 1.2.2 甘蔗中蔗糖的运输
• 1.2.3 甘蔗茎中蔗糖的降解与再合成
• 1.3 无机焦磷酸化酶PPase 基因的研究进展
• 1.4 叶肉细胞特异性表达启动子rbcS 的研究进展
• 1.5 植物遗传转化的方法及甘蔗转基因的研究进展
• 1.5.1 植物遗传转化的方法
• 1.5.2 甘蔗转基因的研究进展
• 1.6 本研究的目的、内容和技术路线
• 1.6.1 研究目的
• 1.6.2 研究内容
• 1.6.3 技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 质粒及菌种
• 2.1.2 试剂
• 2.2 植物表达载体的构建
• 2.2.1 PPase 基因的克隆
• 2.2.2 克隆与测序
• 2.2.3 中间载体pCBIP 的构建
• 2.2.4 植物表达载体pCBIPR 的构建
• 2.3 植物表达载体转化农杆菌
• 2.3.1 转化方法
• 2.3.2 重组子PCR 鉴定
• 2.3.3 转化农杆菌的点杂交鉴定
• 2.4 rbcS 启动子驱使下的PPase 基因遗传转化甘蔗
• 2.4.1 甘蔗转化材料及其农杆菌菌液的准备
• 2.4.2 农杆菌菌液浸染愈伤组织及共培养
• 2.4.3 农杆菌侵染后的愈伤组织分化成苗
• 2.4.4 PPT 筛选浓度预实验
• 2.4.5 甘蔗小植株的筛选培养及定植
• 2.5 转化植株的分子检测
• 2.5.1 植物总DNA 的小量提取
• 2.5.2 PCR 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 PPase 基因的克隆及其序列分析
• 3.2 植物表达载体的构建
• 3.3 植物表达载体导入农杆菌
• 3.4 农杆菌介导的甘蔗转化
• 3.5 转化植株的PCR 检测
• 4 讨论
• 4.1 关于无机焦磷酸化酶基因
• 4.2 关于叶肉细胞特异性表达启动子rbcS
• 4.3 关于农杆菌菌株EHA105
• 4.4 关于筛选
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 缩写词（Abbreviation）
• 8 致谢