论文摘要
结直肠癌是一类严重威胁人类健康和生存的恶性肿瘤,从世界范围看,结直肠癌的发病率居男性恶性肿瘤的第三位,女性第二位。在我国,随着居民生活方式和膳食结构的改变,以及人口老龄化进程的加快,结直肠癌的发病率上升趋势明显。尽管近年来结直肠癌的早期诊断及治疗手段取得了一定的进步,但中晚期结直肠癌患者生存率并没有得到实质性改善,而转移和复发是导致患者死亡的主要原因。因此,积极开展对结直肠癌转移机制的研究,寻找新的关键分子和治疗靶点,对结直肠癌的干预和治疗具有重要的现实意义。上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）是一种基本的生理病理现象,最早在胚胎发育的相关研究领域中提出。一般认为EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转化的现象,在这个过程中,上皮细胞失去极性,细胞间连接消失,上皮标记物表达下调或缺失,而逐渐获得间质细胞形态特征及相关标记物,并且细胞的迁移侵袭能力增强,EMT也可使细胞获得一些干细胞的生物学特性,抵抗凋亡和衰老。同时,在一定的条件下,具有间质表型的肿瘤细胞又可转化为具有上皮表型特征的肿瘤细胞,即间质上皮转化（Mesenchymal-Epithelial Transition, MET）.从结直肠癌经典形态学观察发现,在肿瘤浸润转移过程中存在形态学的可逆性变化,免疫组织化学标记和分子生物学研究证明,结直肠癌细胞存在EMT和MET的过程。在20-40%的结直肠癌组织中所观察到的肿瘤芽被认为是EMT在结直肠癌组织形态上的表现。目前普遍认为EMT在结直肠癌的转移中发挥着重要的作用。有关EMT发生的分子机制及其复杂,细胞内外的多种分子和信号通路参与其中。一些生长因子如TGF-β、FGF、EGF、IGF、HGF. PDGF等通过自分泌或旁分泌的方式,激活胞内不同的信号通路,各种信号通路相互交错形成复杂的网络调控着EMT的发生。其中,TGF-p信号通路研究的最为充分详尽。TGF-β是目前最为常用的EMT诱导因子,在体外实验中,大多数学者采用TGF-β作为诱导肿瘤细胞发生EMT的重要手段。胰岛素样生长因子结合蛋白-相关蛋白1（insulin-like growth factor binding protein-related protein1, IGFBP-rP1）也称为IGFBP7,与传统的IGFBP1-6不同,其与IGF结合能力较低,而与胰岛素的结合能力较强,因此,IGFBP-rP1可能具有不同于传统IGFBP家族成员的新的生物学功能。IGFBP-rP1在不同实验室通过不同的差减文库被筛选到,由于其来源及功能的不同,具有多个不同的命名。我们实验室自从应用抑制性差减杂交法筛选出IGFBP-rP1后,一直致力于其生物学效应和分子机制的研究。我们发现,IGFBP-rP1的过表达可抑制结直肠癌细胞的生长,降低其软琼脂克隆形成能力,诱导细胞凋亡和衰老,在结直肠癌中发挥着潜在的抑癌作用,这在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等肿瘤细胞中也得到了验证。最近一些体内外的研究发现,IGFBP-rP1可影响细胞的迁移侵袭能力,我们前期实验也发现在结直肠癌细胞中采用去甲基化药物5-aza-dC处理恢复IGFBP-rP1的表达后,细胞的迁移侵袭能力减弱。因此,本课题的目的是明确IGFBP-rP1在结直肠癌细胞EMT中的作用,并探讨相关的分子机制。我们在不同的无内源性表达IGFBP-rP1的结直肠癌细胞SW620、CW2及HT29中分别建立了稳定表达IGFBP-rP1的单克隆细胞株,通过Western blot、Real-time RT-PCR、细胞免疫荧光、细胞划痕以及（?）ranswell小室等方法,分析IGFBP-rP1对结直肠癌细胞EMT的影响。我们发现,在结直肠癌细胞中过表达IGFBP-rP1后可上调上皮标记物E-cadherin的表达,其主要分布在细胞膜及细胞浆；而间质标记物N-cadherin, vimentin, MMP9的表达均有不同程度的下调,EMT相关转录因子ZEBl和Snail的表达也显著降低。细胞划痕和Transwell小室迁移实验显示IGFBP-rP1过表达可显著抑制结直肠癌细胞的迁移能力。在无内源性表达IGFBP-rP1的结直肠癌细胞中外源性加入IGFBP-rP1重组蛋白（rhIGFBP-rP1）也可以观察到与转染相似的结果,rhIGFBP-rP1可细微上调上皮标记物的表达,而下调间质标记物的表达。由此可见,在结直肠癌细胞中过表达IGFBP-rP1可抑制EMT过程,也进一步说明IGFBP-rP1可通过自分泌或旁分泌途径而发挥作用。我们进一步选取IGFBP-rP1表达阳性的结直肠癌细胞SW480,采用shRNA干扰的方法沉默IGFBP-rP1的表达,进一步分析IGFBP-rP1与EMT的关系。我们从上海吉玛制药技术有限公司订购了pGPU6/GFP/Neo shRNA Expression Vector Kit,采用Lipofectamine2000试剂进行转染,通过RT-PCR和Western blot的方法对干扰效果进行验证,并筛选到稳定干扰IGFBP-rP1的单克隆细胞株,我们选取两个单克隆进行后续的实验。Western blot结果显示,在SW480细胞中沉默IGFBP-rP1的表达后可显著下调上皮标记物ZO-1的表达,上调间质标记物N-cadherin, vimentin及MMP9的表达。另外,EMT相关转录因子ZEB1和Snail的表达在IGFBP-rP1沉默之后也有不同程度的增加。细胞划痕和Trans well小室实验也证明,在SW480细胞中沉默IGFBP-rP1表达后可显著增强细胞的迁移侵袭能力。以上结果说明,在结直肠癌细胞中沉默IGFBP-rP1表达可促进EMT的发生。另外,我们在稳定干扰IGFBP-rP1的单克隆细胞株中瞬时转染表达载体PcDNA3.1（IGFBP-rP1）或外源性加入rhIGFBP-rP1,观察恢复IGFBP-rP1表达是否可以逆转其沉默所诱导的EMT过程。我们发现恢复IGFBP-rP1表达后可逆转IGFBP-rP1沉默所引起的EMT标记物的表达变化及细胞迁移能力的增加,进一步证明IGFBP-rP1可阻止EMT的发生。复杂的EMT过程也会涉及细胞骨架的变化,我们采用荧光素标记的鬼笔环肽对细胞染色,在激光扫描共聚焦显微镜下直接观察IGFBP-rP1过表达对结直肠癌细胞骨架（F-actin）的影响。结果显示,在原始SW620细胞中,F-actin排列紊乱,无规则,在细胞周边有明显的板状及丝状伪足伸出；空载体对照细胞中也观察到类似现象,而在稳定转染过表达IGFBP-rP1的细胞中,F-actin排列规则,细胞周围无明显伪足形成,这与转染细胞株较弱的迁移能力是相一致的。TGF-β1是最常用的EMT诱导因子,我们以10ng/mlTGF-β1刺激HT29细胞之后, TGF-β/Smad信号通路激活,Smad2/3的磷酸化水平明显增加,HT29细胞在TGF-β1处理之后也出现EMT特征,间质标记物表达上调,细胞迁移能力增加。而外源性加入rhIGFBP-rP1则可逆转TGF-β1所诱导的EMT现象,进一步说明IGFBP-rP1在结直肠癌细胞发生EMT的过程中发挥着抑制作用。同时,rhIGFBP-rP1可抑制TGF-β/Smad言号通路的活性,p-Smad2/3水平明显降低。在结直肠癌细胞中过表达IGFBP-rP1可下调Smad2的磷酸化水平,而沉默IGFBP-rP1后则可上调Smad2的磷酸化水平,这均提示IGFBP-rP1可能通过影响TGF-β/Sma缩号通路发挥作用。我们也初步分析了IGFBP-rP1对Wnt信号通路的影响。首先检测了Wnt信号通路中的关键因子β-catenin,发现在结直肠癌细胞中过表达或沉默IGFBP-rP1并不影响β-catenin在mRNA及蛋白水平上的表达变化,且Wnt信号通路下游靶基因c-myc、 cyclinD1及survivin也未见明显改变,可见IGFBP-rP1对Wnt信号通路并无显著影响。然而采用激光扫描共聚焦显微镜观察β-catenin在细胞中定位情况发现,过表达IGFBP-rP1后可明显减少β-catenin在细胞核中的分布,提取胞核蛋白,采用Western blot险测也发现过表达IGFBP-rP1可减少β-catenin在胞核中的表达。虽然IGFBP-rP1对P-catenin的表达水平没有显著影响,但其可能通过某些机制影响P-catenin在细胞中的分布,利于其粘附功能的发挥而维持上皮细胞表型。综合上述研究结果,我们得出以下结论：1.在结直肠癌细胞中,IGFBP-rP1诱导上皮标记物的表达,下调间质标记物的表达,同时降低细胞的迁移侵袭能力,在EMT过程中发挥抑制作用。2.在结直肠癌细胞中,IGFBP-rP1可能通过影响TGF-β/Smad（?）言号通路抑制EMT过程。