子宫内膜癌和卵巢癌发病机制研究

论文摘要

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一。在欧美等发达国家,其发生率位居首位。在我国,其发生率仅次于宫颈癌。目前据统计,随着人口老龄化和人类寿命的延长,子宫内膜癌的发生率呈现上升趋势。目前来看,对于子宫内膜癌的研究,已经形成一个公认的“二元论”的发病模式,即将子宫内膜癌分为Ⅰ型和Ⅱ型。虽然二者均来自子宫内膜腺体,但实际上被看做是两种完全不同的疾病。相对Ⅰ型而言,Ⅱ型子宫内膜癌的研究较为滞后。由于其病因尚不清楚,通过确立其癌前病变,明确相关发病机制对于早期诊断、改善预后具有重要临床意义。卵巢癌的死亡率在妇科恶性肿瘤中一直高居首位。其主要原因,一是早期诊断困难,75%的患者就诊时已属于晚期。二是由于一直以来,卵巢癌的癌前病变和发病机制的研究尚不清楚。基于此,本课题的研究内容包括以下两部分:1.子宫内膜腺体异型增生（EmGD）中p53基因突变的研究2.Prohibitin介导的促性腺激素平衡机制在卵巢癌中的研究第一部分:子宫内膜腺体异型增生（EmGD）中p53基因突变的研究背景和目的:子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一。在美国等发达国家,其发生率位居首位,在我国仅次于宫颈癌。根据其临床病理特征以及相关分子生物学特点,目前将其主要分为Ⅰ、Ⅱ两种类型。Ⅰ型约占子宫内膜癌的80-90%,以内膜样癌为代表,少部分为粘液性癌。该型多起源于增生期子宫内膜,与雌激素过度刺激有关,预后较好,Ⅰ期患者5年存活率达85-90%。Ⅱ型发病晚于Ⅰ型约10年,绝大多数为浆液性癌,少数为透明细胞癌及其他罕见类型。通常发生于萎缩期或静止期（resting endometrium,RE）子宫内膜,表现为非雌激素依赖性生长,细胞分化差。虽然Ⅱ型仅占子宫内膜癌的10-15%,但确诊时多数已经伴有子宫外转移,5年存活率显著降低。目前统计显示,随着人类寿命的延长和人口老龄化,子宫内膜癌的发生率存在上升趋势,因此,仍应当对此给予足够的重视,尤其对于行为恶劣的子宫内膜浆液性癌（endometrial serous carcinoma,ESC）,对其研究显得更为必要。癌前病变是一种可能发展为癌但还不是癌,位于正常和癌之间的一种过度性病变。癌前病变的研究对于早期诊断、及时治疗、改善预后有重要的临床指导意义。相对Ⅰ型而言,Ⅱ型子宫内膜癌的癌前病变研究比较落后。在1992年,Sherman ME首次描述了“在子宫浆液性癌的子宫内膜表面靠近癌灶区域,存在一些细胞学上与浸润性浆液性癌相似的恶性肿瘤细胞”,将其命名为“上皮内癌”。1995年,Ambros RA进一步明确了这种上皮内癌与浆液性癌的密切关系。此后,“子宫内膜上皮内癌”（endometrial intraepithelial carcinoma,EIC）正式使用,当时被认为是ESC的癌前病变。几乎与此同时,Spiegel GW将这种病变描述为“子宫内膜原位癌”（endometrial carcinoma in situ,ECIS）。在形态学上,EIC或ECIS指子宫内膜表面上皮或腺体被与ESC类似的恶性细胞所取代,但没有肌层和间质浸犯。由于EIC的实际诊断中,很难将其和不伴有肌层浸润的局部微小间质浸润癌区分开来,于是Wheeler DT等提出了子宫微小浆液性癌（minimal uterineserous carcinoma,MUSC）,将直径1cm之内的内膜表面浆液性癌一并包括在内,它和EIC具有相同的形态学和临床特点。2003年,EIC作为ESC的癌前病变,被世界卫生组织（WHO）所接受。然而,这一概念一经提出就引起激烈讨论。因为发生在其他组织（如乳腺和宫颈）的上皮内癌都局限于上皮内,不存在任何转移灶,而研究表明14-25%的EIC伴有宫颈浸润,33-67%的EIC或IA期ESC伴有子宫外病变,预后不良。即使是病灶局限的EIC,子宫外有病灶的患者的生存期仅在36—38个月左右。鉴于这种特点,1998年Zheng W（郑文新）等提出子宫内膜表面癌（uterine surfacecarcinoma,USC）,强调同时伴发其他部位病变的潜在可能性。已经明确EIC多数起源于RE,那么正常的RE如何突然转化成细胞分化较差的EIC?EIC是否是真正的前驱病变?二者之间是否存在另外一种过度形态?2004年,Zheng W所带领的研究小组发现静止期（包括萎缩期以及轻度增生和增生期）子宫内膜（restingendometrium,RE）进展到EIC之前的确存在一种形态,其细胞异型性介于二者之间,将其命名为“子宫内膜腺体异型增生”（endometrial glandular dysplasia,EmGD）。免疫组化显示,EmGD中p53、MIB—1和IMP3的表达介于良恶性之间。染色体17p和1p的杂合性分析也呈现类似结果,并且69.2%的子宫标本中,EmGD和EIC、ESC的等位基因缺失图谱表现一致。回顾性分析发现EmGD患者发展为ESC的危险性是正常人的9倍,平均时间约为33个月。综上所述,从细胞形态学以及临床行为来看,EIC是一种早期癌,很可能由EmGD发展而来,EmGD很有可能是ESC的癌前病变。恶性肿瘤的发生是一个多步骤、多阶段的过程,同时伴有癌基因/抑癌基因的突变并不断累积。P53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。资料表明,40-50%的晚期子宫内膜癌与p53基因改变有关。在浆液性子宫癌中,p53突变作为一种早期事件,直接与80%的EIC发生相关。目前在其他肿瘤中已经通过比较肿瘤中多个不同中心的p53突变图谱,来分析肿瘤的克隆起源。因此,我们推测EmGD作为一种可靠的癌前病变,也应当存在一定程度的p53基因改变,并且相同的改变出现于相应的EIC和ESC中。因此,本实验通过分析EmGD、EIC和ESC中的p53基因变化图谱,进一步从基因学角度为EmGD作为EIC/ESC的癌前病变这一发现提供证据。方法:所有2000—2007年间的27例子宫标本来自美国耶鲁大学和亚利桑那大学医学院病理科。15个子宫肿瘤标本均包含EmGD病变,ESC 9例,混合型（浆液性分化部分至少50%,EIC和EmGD未见透明细胞等非浆液性细胞变化）2例,EIC 3例和单纯EmGD1例。FIGO分期包括ⅠA期3例,ⅠB期2例,ⅠC期1例,ⅡA期2例,ⅢA期1例,ⅢC期4例和ⅣB期1例,平均年龄68岁,术前未行任何放射和化学治疗。EmGD的诊断标准主要表现为细胞核异型性、p53和MIB—1免疫组化介于RE和EIC之间。对照组12例良性子宫均来自因其他良性妇科疾病行子宫切除的绝经后妇女,子宫脱垂6例,子宫肌瘤3例,绝经后阴道流血3例,平均年龄63岁。萎缩期子宫内膜5例,轻度增生期4例,增生期3例。对所有标本中的不同病变,多个中心进行准确激光显微切割（laser capturemicrodissection,LCM）。由于EmGD病灶间距通常在1 mm之内,我们将病变间距大于2 mm的规定为不同中心。从肿瘤标本中共切割115个可分析标本,RE=31,EmGD=37,EIC=25,ESC=22。另外还有24个RE来自良性对照组。聚合酶链式反应对以上标本中p53的外显子5—8进行扩增,所得产物纯化后经DNA 3730测序仪测序分析。同时对所有子宫标本行p53免疫组织化学分析,以探讨蛋白表达和基因突变之间的关系。结果:1.在RE,EmGD,EIC和ESC中,p53的突变率分别为0,43.2%,72.0%,和95.5%。与EmGD相比,EIC和ESC中p53突变率显著增高（P＜0.01）。2.除1例单纯EmGD子宫外,其余14例EmGD,ESC和/或EIC并存的子宫中,11例发生p53突变。其中6例表现为EmGD和ESC和/或EIC同时发生p53改变,并且所有的EmGD改变均存在于相应的ESC和/或EIC中（6/11,54.5%）。其余5例EmGD p53改变阴性,仅EIC和ESC表现p53基因改变,其中4例变化图谱相同。3.其中1例子宫不同部位的EmGD表现为不一致的p53改变。4.P53免疫组化检测和基因序列改变之间的相关性为85.2%（P＜0.01）。结论:1.P53基因突变是ESC启动发生中的重要因素。2.本研究为EmGD成为EIC/ESC的癌前病变这一推测提供了证据。将有助于早期诊断和有效控制ESC。3.P53免疫组化仍可作为EmGD、EIC和ESC的有效辅助诊断手段。第二部分:Prohibitin介导的促性腺激素平衡机制在卵巢癌中的研究背景及目的:在妇科肿瘤中,卵巢癌的死亡率一直位居首位。由于解剖上卵巢位于盆腔深部,早期病变不易被发现,加上多数卵巢癌发生于绝经后妇女,此时卵巢已基本不再发挥生理作用,也致使卵巢病变缺乏特异的症状。结果导致70%的患者确诊时已属晚期,5年存活率仅为10%左右。而对于早期卵巢癌,高达80%患者的仅手术就可以治愈。可见,早期诊断卵巢癌具有重要的临床价值。但是,目前为止,还没有一项早期检测手段通过临床验证,能同时具备较高的诊断敏感性和特异性。虽然手术和化学治疗能够暂时缓解晚期卵巢癌患者,但化疗耐药的产生使多数患者往往短期内复发。近30多年的努力也没有使卵巢癌的预后得到明显改善,5年存活率徘徊在45%左右。目前基因靶向治疗呈现出良好的前景,但是卵巢癌的高度异质性成为其发展的主要障碍。由此可见,卵巢癌的诊断治疗仍然是目前面临的一大挑战。从病因、癌前病变到发病机制的研究任重而道远。卵巢内的各种细胞都可以形成肿瘤,但组织学上最常见的主要有上皮细胞肿瘤,生殖细胞肿瘤和性索—间质细胞肿瘤。在卵巢恶性肿瘤中,90%以上的为卵巢上皮癌（ovarian epithelial cancer,OEC）。多数学者认为OEC来源于覆盖于卵巢表面的一层扁平—立方上皮,即卵巢表面上皮（ovarian surface epithelium,OSE）。OSE来源于胚胎发育时期的体腔上皮,和苗勒管上皮具有共同的胚胎起源,苗勒管上皮进一步分化为女性的内生殖器官内膜。因此,类似邻近的苗勒管上皮,成年女性的OSE具有分化的潜在能力,在激素、炎症等外界刺激作用下,可以向输卵管内膜,子宫内膜和宫颈内膜分化,从而形成相应的浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤和粘液性肿瘤。排卵后,OSE向卵巢间质内陷,形成包涵囊肿（ovarianepithelial inclusions,OEI）。间质微环境内高水平的促性腺激素、生长因子、细胞因子等的刺激作用,能够促进这些上皮发生化生和瘤样改变。因此,OSE和OEI可被认为是OEC的癌前阶段。至今,卵巢癌的确切发病机制仍不清楚。基于流行病学观察资料,就此形成以下几种学说。（1）持续排卵学说,该学说认为反复排卵导致OSE不断受损,在OSE迅速增生修复过程中,基因异常的几率也相应增加。所以,月经初潮早、绝经迟和未生育的妇女,其卵巢癌的发生风险也增加。相反,多次妊娠、哺乳和应用避孕药则对卵巢起到保护作用。（2）促性腺激素学说,即卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）对OSE的持续过度刺激,能促进OSE的恶性转化。绝经后妇女由于卵巢的负反馈作用下降,FSH和LH水平升高,而据统计,85-90%的OEC发生于围绝经期和绝经后妇女,在此基础上提出了该学说。妊娠、哺乳和应用避孕药所起到的保护作用都与促性腺激素水平的反馈性降低有关。后来,在OSE和OEC细胞和组织中发现了FSH和LH受体,从而进一步确立了促性腺激素和卵巢癌的关系。（3）甾体类激素学说,指在卵巢癌发生过程中,通过与相应受体结合,雄激素和雌激素起到促进作用,而孕激素具有保护作用。雄激素是卵泡发育过程中产生最多的激素,直接作用于卵泡旁OEI,可导致上皮增生。多囊卵巢综合征的妇女排卵次数减少,但卵巢癌的发生风险增加,这可能和雄激素水平增高有关。雌激素对卵巢癌细胞的生长和浸润起到促进作用。妊娠期间孕激素的保护作用远远超过不排卵所起的作用。单一孕激素避孕药不影响排卵,但通过孕激素作用可降低卵巢癌的发生风险。（4）炎症学说,认为盆腔炎症能增加卵巢癌的风险,排卵本身类似一种炎症反应过程,伴随细胞因子的释放,炎症细胞浓度数量的升高以及组织结构的重建修复,使细胞突变的可能性增加。子宫内膜异位症伴有局部的炎症反应,目前研究认为这种良性改变是卵巢子宫内膜样癌和透明细胞癌的癌前病变。子宫切除和输卵管结扎,可能通过阻断外界刺激因子的进入,对卵巢上皮起到保护作用。以上学说提出之后,人们开始从分子生物学角度寻找支持证据。相继多个研究小组在OSE和OEC细胞和组织中检测到FSH和LH受体,表明他们作为靶细胞,能够与促性腺激素相互作用。但具体作用结果存在争议,多数认为FSH和LH能够促进细胞增殖,但也有研究小组发现FSH和LH对细胞生长没有作用,甚至能够抑制细胞生长。这种异议可能和细胞来源、激素浓度、作用时细胞生长情况有关。促性腺激素可以通过VEGF,EGFR,CD44,MMP2和MMP 9在卵巢癌血管形成、浸润和转移中发挥作用。其中涉及到IL-6/STAT3、PKC、PKA、PI3K、MAPK和ERK-1/-2等信号通路。由此可见,促性腺激素在卵巢癌发生中的作用机制相当复杂,仍待进一步阐明。2000年,Zheng W（郑文新）等进行体外研究发现FSH和LH对卵巢癌细胞具有不同的作用,FSH能促进细胞增殖,LH没有任何作用,但是当二者共同存在时,LH则能够拮抗FSH的促进作用。为进一步阐明其中的分子机制,本研究应用蛋白质组学的方法,寻找在卵巢癌发生过程中,与FSH和LH作用相关的特异性蛋白,从而进一步揭示促性腺激素在这一过程中所扮演的角色。方法:本实验选用MCV152细胞,即永生化的良性卵巢浆液性囊腺瘤细胞。细胞经FSH和LH分别作用后,提取细胞全蛋白进行二维凝胶电泳（2DGE）分析。液相色谱串联质谱对差异显著的蛋白质点进行鉴定。之后Western blot和免疫组化检测细胞和组织中蛋白（prohibitin）的表达情况。为研究prohibitin在卵巢癌形成中的作用,siRNA瞬时转染细胞,应用MTT和细胞流式细胞学观察prohibitin低表达对细胞生长及周期的影响。结果:共鉴定10个促性腺激素特异性蛋白,与对照组相比,改变均在3倍以上（P＜0.05）。其中prohibitin受LH特异性调节,表达呈LH剂量依赖性,与FSH无关。与单一LH相比,二者共同作用时prohibitin的表达量增加1.5倍以上。80%以上的prohibitin被抑制之后,细胞生长加快,细胞数量增加40%以上,G0/G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞相应增加。卵巢组织中免疫组化结果显示,prohibitin在良性组织中广泛表达,其中以下组织中高表达,包括卵泡细胞（颗粒细胞,7/7,100%;卵泡膜细胞7/7,100%）,黄体化的卵巢间质细胞（8/8,100%）,OSE（16/16,100%）和浆液性分化的OEI（14/14,100%）。非黄体化的卵巢间质细胞中prohibitin表达指数（29）显著低于黄体化的卵巢间质细胞（288）（P＜0.01）。在卵巢上皮细胞,prohibitin的表达水平从OSE（100%）,OEI（83%）到良性（71%）,交界性肿瘤（64%）及卵巢癌（45%）逐渐降低（P＜0.0001）。从组织学类型上,浆液性和子宫内膜样上皮中（72/88,82%）prohibitin显著高于粘液性上皮（13/39,33%）（P＜0.0001）。在卵巢癌中,prohibitin的表达与分化程度负相关。结论:1.在卵巢癌的发生过程中,LH具有一定的抑制作用,通过上调prohibitin是实现其抑制作用的机制之一。2.研究FSH和LH共同存在时对卵巢上皮细胞的作用对探索卵巢癌的发生机制,改进治疗手段具有重要意义。以上研究均是建立在一定的前期研究基础之上,着重于发病机制方面的探讨。创新性体现在:1.我们研究小组前期提出EmGD是子宫浆液性癌可能的癌前病变。本研究首次通过p53基因状态的分析,为其成为子宫浆液性癌的癌前病变提供了遗传学证据。2.首次发现prohibitin的正常表达对卵巢上皮起到保护作用,其表达降低或者缺失能促进卵巢癌的发生与进展。3.提出了“促性腺激素平衡”假说,即在卵巢癌的发生过程中,LH和FSH之间存在着平衡调节机制,prohibitin可能参与了二者之间的调节。

论文目录

• TABLE OF CONTENTS
• ABSTRACT
• 中文摘要
• GLOSSARY
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• PART ONE
• Chapter One - Introduction
• 1.1 Endometrial carcinoma
• 1.2 Endometrial serous carcinoma and its precursor - endometrial glandular dysplasia （EmGD）
• 1.3 P53 alternation - the role in clonality analysis
• 1.4 Aim of this study
• Chapter Two - Materials and Methods
• 2.1 Materials
• 2.1.1 Case selection
• 2.1.2 Clinicopathological features
• 2.1.3 Major reagents
• 2.1.4 Major equipments
• 2.1.5 Tailed primers
• 2.2 Methods
• 2.2.1 Laser capture microdissection （LCM）
• 2.2.2 DNA extraction
• 2.2.3 Two-step polymerase chain reaction （PCR）
• 2.2.4 PCR product purification
• 2.2.5 DNA sequencing analysis
• 2.2.6 P53 immunohistochemistry （IHC） and score
• 2.2.7 Statistical analysis
• Chapter Three - Results
• 3.1 Overall p53 mutations
• 3.2 EmGD contained frequent p53 gene mutations
• 3.3 P53 mutations in RE, EmGD, serous EIC and ESC
• 3.3.1 Increased frequency of p53 mutations from RE to EmGD, to serous EIC and/or ESC
• 3.3.2 High concordant p53 mutations observed in EmGD, serous EIC and/or ESC
• 3.4 Correlated p53 mutation analysis and p53 IHC staining
• Chapter Four - Discussion
• 4.1 A dualistic model of sporadic endometrial carcinogenesis
• 4.1.1 Molecular genetic basis
• 4.1.2 Precancer studies
• 4.1.3 Progression models
• 4.2 EmGD, instead of serous EIC, as a precancer for ESC
• 4.2.1 Serous EIC intrinsically represents an early form of ESC
• 4.2.2 EmGD meets the criteria to be a precancer
• 4.3 P53 alteration - an early event in ESC development
• 4.3.1 EmGD is a neoplastic entity
• 4.3.2 EmGD occurs before serous EIC and ESC
• 4.3.3 Possible mechanisms involved in ESC development
• 4.4 P53 IHC staining - a useful diagnostic marker for EmGD
• 4.5 Clinical management of EmGD
• 4.6 Conclusions and future work
• 4.7 Related publications
• Chapter Five - Reference
• PART TWO
• Chapter One - Introduction
• 1.1 Ovarian surface epithelium （OSE）
• 1.2 Etiology
• 1.3 Follicular stimulating hormone （FSH） and luteinizing hormone （LH） and their receptors FSHR, LHR
• 1.4 Aim of this study
• Chapter Two - Materials and Methods
• 2.1 Materials
• 2.1.1 Cell lines and gonadotropins
• 2.1.2 Case selection
• 2.1.3 Clinicopathological features
• 2.1.4 Major reagents
• 2.1.5 Major equipments
• 2.2 Methods
• 2.2.1 Cell culture and gonadotropins' stimulation
• 2.2.2 Two-dimensional gel electrophoresis （2DGE）
• 2.2.3 Image analysis and in-gel digestion
• 2.2.4 Mass spectrometry and protein identification
• 2.2.5 Western blot
• 2.2.6 RNA interference and MTT assay
• 2.2.7 Cell cycle analysis
• 2.2.8 Prohibitin immunohistochemistry （IHC） and evaluation
• 2.2.9 Statistical analysis
• Chapter Three - Results
• 3.1 Comparative proteomic analysis and protein identification
• 3.2 Prohibitin expression regulated by gonadotropins
• 3.3 Effects of prohibitin RNA interference on cell growth
• 3.4 Prohibitin expression in human ovarian tissue
• Chapter Four - Discussion
• 4.1 Gonadotropins and OEC
• 4.1.1 Epidemiological evidences
• 4.1.2 Receptors of gonadotropins in OSE and OEC cells
• 4.1.3 Effects of gonadotropins on OSE and OEC cells
• 4.2 Prohibitin, a tumor suppressor and its role in carcinogenesis
• 4.3 Prohibitin, serving as a balancing factor between FSH & LH
• 4.4 Gonadotropin balancing theory
• 4.5 Prohibitin, a protective factor in ovarian carcinogenesis
• 4.6 Conclusions and future work
• 4.7 Related publications
• Chapter Five - Reference
• SUMMARY
• ACKNOWLEDGEMENTS
• LIST OF PUBLICATIONS
• 附录
• 学位论文评阅及答辩情况表