鳗弧菌基因组Fosmid库的构建及毒力相关因子的筛查

论文摘要

鳗弧菌（Vibrio anguillarum）是一种对鱼类危害严重的细菌病原,常给水产养殖业造成巨大的经济损失。由于鳗弧菌的基因组信息尚未阐明,限制了许多研究工作的深入开展。本研究构建了鳗弧菌的Fosmid基因组文库,对文库的部分克隆进行了末端测序;根据序列的生物信息学分析,对可能的毒力相关因子进行了预测;在此基础上从文库克隆和鉴定了一个营养必须基因（aroA）和一个蛋白酶基因（prtV）。主要结果如下:1、鳗弧菌Fosmid基因组文库的构建和鉴定本研究构建了鳗弧菌的Fosmid基因组文库,该文库包含960个克隆,插入片断平均长度为40 kb。该文库覆盖鳗弧菌基因组（估计为5Mb）的9.1倍,得到任意单拷贝DNA序列的概率大于99%。同时我们建立了该文库的超级池和二级池,用于目的基因的的PCR筛选,所筛选的11个基因的阳性克隆数在2 -11之间,表明该文库可以很好地用于目的基因的筛选。2、鳗弧菌Fosmid基因组文库末端序列分析从鳗弧菌Fosmid基因组文库随机挑取600个克隆进行双末端测序,获得927条序列。加上原有随机片断文库的442条序列,共获得序列总长646,472bp,大约占基因组的19.35%。对这些序列进行如下分析:首先,BLASTN比对结果表明在1369条序列中,有718条序列与数据库现有的序列有明显的相似性（E< e-5）,占测序总数的52.44%。BLASTX比对结果,与nr数据库序列相似的有1106条;与EST数据库相似的有826条。其次,根据文库BLASTX的比对结果及相关文献资料,预测出与毒力相关的基因24个,分别为溶血素基因3个,重复序列毒素基因4个,鞭毛基因9个,菌毛基因2个,蛋白酶基因6个。3、从鳗弧菌Fosmid基因组文库克隆aroA基因从鳗弧菌Fosmid基因组文库筛出含有aroA基因的克隆,经genomic walking PCR得到aroA全基因。该基因全长1281 bp,编码427个氨基酸残基,含有一个11个氨基酸残基的信号肽。分子量为46,177 Dalton。鳗弧菌aroA的蛋白编码序列与其他细菌的aroA同源,序列相似性在78%-82%。4、PrtV基因的克隆及鉴定从鳗弧菌Fosmid基因组文库克隆prtV基因,该基因序列全长2778bp,编码926个氨基酸,分子量约102kDa。构建了PrtV基因插入失活突变株及其互补株。PrtV基因缺失后,生长能力有所下降,细菌的明胶酶活性、N -乙酰-葡萄糖胺酶活性下降,溶血活性下降,毒力与野生型相比下降了两个数量级,因此PrtV基因对鳗弧菌毒力有明显的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 引言
• 第一节 微生物基因组学研究
• 1 微生物基因组研究方法
• 1.1 模式微生物基因组的研究
• 1.2 最小基因组研究
• 1.3 比较基因组学研究
• 1.4 生物信息学研究
• 2 病原微生物功能基因组学的研究
• 2.1 对Koch 氏原则和毒力基因概念的新认识
• 2.2 病原菌功能基因组学的研究
• 第二节 鳗弧菌毒力相关基因的研究进展
• 引言
• 1 外毒素（exotoxin）
• 1.1 溶血素（hemolysin）
• 1.2 重复序列毒素（repeat in toxin，RTX）
• 2 粘附因子（adherence／clonization factor）
• 2.1 鞭毛（flagellum）
• 2.2 菌毛（pilus）
• 3 侵袭因子（invasion factor）
• 4 细胞表面成分（cell surface components）
• 5 铁吸收系统（iron uptake system）
• 第二章 鳗弧菌Fosmid 基因组文库的构建和特性分析
• 第一节 鳗弧菌Fosmid 基因组文库的构建
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 结果与讨论
• 2.1 高质量基因组DNA 的获得
• 2.2 末端修复及合适片断的回收
• 2.3 包装及转导
• 2.4 克隆的保存
• 2.5 超级池的构建
• 2.6 文库鉴定
• 第二节 鳗弧菌基因组的特征分析
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 测序结果
• 2.2 生物信息学分析
• 2.3 影响鳗弧菌毒力基因的预测
• 3 讨论
• 3.1 测序结果
• 3.2 毒力基因的预测
• 第三章 从鳗弧菌M3 Fosmid 文库筛选aroA 基因
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 从鳗弧菌M3 Fosmid 文库筛选aroA 基因的策略
• 1.2 生物信息学分析
• 2 结果
• 2.1 从鳗弧菌M3 Fosmid 文库中克隆aroA 基因
• 2.2 鳗弧菌M3 aroA 基因核苷酸序列分析
• 2.3 鳗弧菌aroA 基因氨基酸序列分析
• 3 讨论
• 第四章 鳗弧菌 PrtV 基因的功能鉴定
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 从鳗弧菌M3 Fosmid 文库筛选PrtV 基因
• 1.2 鳗弧菌PrtV 基因插入失活突变株构建策略
• 1.3 鳗弧菌PrtV 基因插入失活突变株互补株的构建
• 1.4 鳗弧菌PrtV 基因插入失活突变株及互补株的毒力及生化鉴定
• 2 结果
• 2.1 从鳗弧菌M3 Fosmid 文库中克隆PrtV 基因
• 2.2 PrtV 基因插入失活突变株的构建和互补株的构建
• 2.3 毒力及生化鉴定
• 3 讨论
• 个人简介
• 学术成果
• 参考文献
• 致谢