西农萨能羊乳腺脂肪酸合酶（FAS）基因及其启动子的克隆、测序与分析

论文摘要

脂肪酸合酶（Fatty acid synthase, FAS;EC 2.3.1.85）在哺乳动物的脂肪酸合成过程中具有重要作用,它利用乙酰-CoA、丙二酸单酰-CoA和NADPH催化饱和脂肪酸的合成。山羊乳腺短、中链脂肪酸合成受到FAS中的乙酰/丙二酸单酰基转移酶（Acetyl-CoA and malonyl-CoA transacylases, AT/MT）功能域的转酰基作用调控。通过调控FAS基因表达而改变山羊乳脂肪酸组成,将成为从遗传育种的角度解决山羊乳膻味问题的重要手段之一。对山羊乳短、中链脂肪酸代谢的研究可以为羊奶膻味的形成机理提供依据,同时在如何合理利用羊奶脂肪酸的特点,提高羊奶中对人体有益的脂肪酸含量方面也具有重要现实意义。本研究以西北农林科技大学萨能羊原种场和陕西省千阳县种羊场的足月正常分娩、健康的西农萨能羊为试验材料,运用RT-PCR结合RACE的方法获得了西农萨能羊乳腺FAS基因cDNA序列全长,并对FAS基因启动子部分序列进行了克隆和序列分析;采用实时定量PCR的方法检测了不同泌乳阶段（盛期、中期、后期、末期及干奶期）西农萨能羊乳腺FAS基因mRNA的表达丰度。该研究旨在为西农萨能羊乳腺FAS基因的功能研究奠定基础,通过掌握FAS基因表达规律,为山羊乳腺脂肪酸代谢、FAS基因功能以及山羊奶膻味的遗传调控机理研究提供试验依据。试验结果如下:1.克隆获得了西农萨能羊FAS基因编码区KS功能域（exon2-exon9）、AT/MT功能域（exon8-exon16）、DH-ACP功能域（exon16-exon39）及TE功能域（exon39-exon42）等四个片段,大小分别为1052 bp、1449 bp、4356 bp和787 bp,登录GenBank,收录号分别为EF042286、DQ915966、EF068247、EF059988（数据已公布）,3′末端和5′末端序列长度分别为1250 bp和360 bp,将六个片段进行序列拼接首次完成了西农萨能羊FAS基因共8217 bp的cDNA序列全长,编码2514个氨基酸残基;2.克隆获得西农萨能羊FAS基因启动子序列片段719 bp,GenBank收录号EF556550（数据尚未公布）,序列分析表明TATA盒位于-41 bp处,一个类似于CAAT盒的序列位于-74 bp处,这些都是典型的真核生物启动子元件。TATA盒上游区域有76%以上的G/C含量和四个GC盒（GGGCGG和CCGCCC）,潜在的核转录因子结合位点Sp1位于-99 bp、-174 bp、-255 bp和-320 bp;3.泌乳末期乳腺中FAS基因mRNA表达水平最高,干奶期则最低。西农萨能羊乳腺FAS基因在不同泌乳阶段mRNA表达量存在差异,其含量变化规律可能与产奶量及乳脂率的变化相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 山羊奶脂肪酸组成及其营养价值
• 1.2 乳腺脂肪酸的合成机制
• 1.3 乳腺中脂肪酸合成的种间差异
• 1.4 山羊奶膻味研究现状
• 1.5 短、中链脂肪酸与FAS 合成调控
• 1.5.1 高等植物脂肪酸合成与FAS 的调控
• 1.5.2 反刍动物乳腺脂肪酸合成机理的研究进展
• 1.6 非反刍动物脂肪酸合成与 FAS 的调控
• 1.7 反刍动物脂肪酸合成与FAS 的调控
• 1.8 脂肪酸合酶（FAS）的研究进展
• 1.8.1 脂肪酸合酶的概念及功能
• 1.8.2 脂肪酸合酶基因的研究进展
• 1.9 生物信息学分析简介
• 1.10 本研究的目的意义
• 第二章 西农萨能羊乳腺脂肪酸合酶（FAS）基因cDNA 序列全长的克隆与序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 引物设计与合成
• 2.1.4 西农萨能羊乳腺组织总RNA 的提取及第一条cDNA 链的生成
• 2.1.5 FAS 基因KS 域（ex0112-ex0119）的扩
• 2.1.6 FAS 基因AT/MT 域（ex0118-ex01116）的扩
• 2.1.7 FAS 基因DH-ACP 域（ex01116-ex01139）的扩
• 2.1.8 FAS 基因TE 域（ex01139-ex01142）的扩
• 2.1.9 FAS 基因3′-UTR 的扩增（3′RACE）
• 2.1.10 FAS 基因5′-UTR 的扩增（5′RACE）
• 2.1.11 目的基因片段的纯化
• 2.1.12 目的基因的连接和转化
• 2.1.13 阳性克隆产物的鉴定
• 2.1.14 序列拼接获得西农萨能羊乳腺 FAS 基因cDNA 全长
• 2.1.15 序列分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 乳腺总RNA 的提取
• 2.2.2 FAS 基因KS、AT/MT、DH-ACP 及TE 功能域的克隆
• 2.2.3 FAS 基因3′非翻译区（3′-UTR）和5′非翻译区（5′-UTR）的克隆
• 2.2.4 西农萨能羊乳腺FAS 基因cDNA 全长序列的获得
• 2.2.5 FAS 基因推导的氨基酸序列分析
• 2.2.6 西农萨能羊FAS 基因各功能域的确定
• 2.2.7 西农萨能羊FAS 基因序列同源性和结构预测分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于PCR 引物的设计
• 2.3.2 关于总RNA 提取及目的基因的扩增
• 2.3.3 关于FAS 基因的调控与山羊乳短、中链脂肪酸合成的关系
• 2.3.4 FAS 基因在不同组织中的表达
• 第三章 西农萨能羊脂肪酸合酶（FAS）基因启动子序列的克隆与序列分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 样品采集
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 基因组DNA 的提取
• 3.1.4 FAS 基因启动子扩增引物设计
• 3.1.5 FAS 基因启动子克隆及鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 FAS 基因启动子序列的克隆
• 3.2.2 FAS 基因启动子序列分析
• 3.3 讨论
• 第四章 西农萨能羊不同泌乳阶段乳腺脂肪酸合酶（FAS）基因表达丰度研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 样品采集
• 4.1.2 总RNA 提取
• 4.1.3 cDNA 第一条链的生成
• 4.1.4 PCR 引物设计
• 4.1.5 实时定量PCR 分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 总RNA 的提取及检测
• 4.2.2 实时定量PCR
• 4.3 讨论
• 主要结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介