BK通道相邻亚基间残基耦合作用对孔道结构及门控的影响

论文摘要

离子通道作为一种膜蛋白在动物、植物、单细胞或多细胞生物的细胞膜上广泛存在,产生细胞生物电现象。钙依赖、电压激活的大电导钾通道（BK通道）作为钾离子通道家族中的一员,在线虫、昆虫和哺乳动物的肌肉、脑、胰腺、背根神经节上都有表达,广泛地存在于各种兴奋和非兴奋细胞中。在生理过程中,BK通道扮演着十分重要的角色。所以对BK通道孔道结构和门控机制的研究一直是热点领域。在本文中,我们着重运用了电生理膜片钳、分子生物学构建、点突变、细胞培养、荧光成像以及分子动力学结构模拟等技术,探讨了BK通道孔道区域内Leu-312位点的氨基酸残基与相邻亚基上Phe-315位点的氨基酸残基之间的相互耦合作用对于维持通道关闭态构象的稳定以及通道门控调节的影响。主要内容如下:通过mSlo1、KcsA、MthK和Kv1.2的同源序列比对以及对已知的三种钾离子通道晶体结构的分析,我们重点关注了门控枢纽点附近的两个线性排列氨基酸Leu-312和Phe-315,推测它们之间可能存在某种相互作用。进一步的研究表明,这两个位点确实对BK通道的门控和孔道结构有重要影响。大部分的Leu-312突变体不同程度地增强了通道的激活,加大了开放几率,降低了钙离子和电压的敏感性,有些突变体甚至在没有胞内自由钙离子和很负电压的情况下表现出了“长开”的特殊性质。而很多Phe-315突变体能正常表达上膜,却记录不到可探测的宏观电流,表明它们丧失了正常的通道功能。能够记录到电流的Phe-315位点的突变F315Q,则表现出了和Leu-312位点的突变L312Q相似的性质。但是无论是这两个位点的哪种突变体,都没有改变单通道电导大小,表明通道门控被影响了,但通道处于开放态时孔道门的构象并没有发生改变。通过分子动力学模拟,我们发现野生型BK通道处于关闭态时Leu-312位点和相邻亚基上的Phe-315位点有一个非常近的通信距离,表明它们之间存在紧密的相互作用,我们称之为L-F耦合。一旦突变了其中某个位点,这种耦合作用就会被破坏,使通道的孔道不能维持正常的关闭态构象,从而表现出了“长开”的性质。综上所述,BK通道孔道区域内Leu-312位点和相邻亚基上Phe-315位点的疏水耦合作用能维持通道关闭态构象的稳定,使通道维持正常功能,并且在不改变孔道门结构的同时对通道门控产生非常大的影响。Leu-312和Phe-315突变使通道对钙离子和电压敏感性的丧失,表明它们之间的这种相互作用可能还影响了钙离子敏感器和电压敏感器与通道孔道门之间的耦合。这个发现也为我们研究其他BK类型的离子通道孔道的结构和门控提供了一个新的视角和思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 离子通道的基本知识
• 1.2 BK通道的功能与结构特征
• 1.3 本课题的主要研究内容
• 2 实验原理与技术
• 2.1 膜片钳技术
• 2.2 免疫荧光技术
• 2.3 细胞培养技术
• 2.4 通道蛋白表达相关技术
• 3 BK通道相邻亚基间L312和F315残基耦合作用的研究
• 3.1 背景
• 3.2 实验材料和方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 4 全文总结与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读博士学位期间发表的论文目录
• 附录2 氨基酸名称、简写、疏水性和体积
• 附录3 主要缩略词