海藻酸钠微囊包覆HEK293细胞缓释lefty用于肿瘤逆转治疗的研究

海藻酸钠微囊包覆HEK293细胞缓释lefty用于肿瘤逆转治疗的研究

论文摘要

近年来的研究表明,胚胎组织的微环境可通过表观遗传学机制使肿瘤细胞逆向转化为表型正常的细胞,nodal信号蛋白的抑制因子lefty在该过程中发挥了十分关键的作用。由于lefty可以逆转肿瘤的表型而对正常的细胞没有影响,这一发现为肿瘤的逆转治疗提供了新的分子治疗靶点。但lefty主要在胚胎干细胞中高水平表达,在正常的组织和肿瘤组织中呈低水平表达。目前原核生物的表达系统制备的基因重组蛋白由于缺乏糖基化修饰药效很低,采用真核细胞表达系统面临蛋白产量较低、造价昂贵和临床使用不便的缺点。因此,如何将lefty用于肿瘤细胞的治疗是本课题主要解决的问题。本研究提出采用细胞微囊化技术局部缓释lefty实现对肿瘤进行逆转化治疗的设想。本研究首先构建了pCDNA3.1-LEFTY1和pIRES-GFP-LEFTY2重组体质粒,然后通过细胞转染技术构建了稳定表达lefty蛋白的HEK293-pIRES-GFP-LEFTY2和HEK293-pCDNA3.1-LEFTY1细胞株,构建的pIRES-GFP双表达表达系统能够有效的监控lefty2的表达效率。采用western blot检测lefty1和lefty2蛋白能够分泌到培养基中。鉴于海藻酸钠高分子缺乏细胞粘附分子,本研究通过明胶改性,制备了明胶-海藻酸钠复合微囊,使得HEK293细胞在微囊内的存活得到改善。本课题还自制了高压静电微囊发生器一台,利用该设备可以成功的将微囊的直径控制在100μm左右。通过细胞微囊化技术将稳定表达lefty蛋白的HEK293细胞株包覆到海藻酸钠微囊内,成功构建了缓释lefty的微囊化系统。将该缓释系统植入CD1小鼠体内,利用ELISA技术检测了lefty1在小鼠血清内的含量和持续表达时间。利用与乳腺癌细胞MDA-MB231进行共培养研究,研究体外缓释lefty蛋白对肿瘤细胞的影响。结果表明缓释的lefty能够抑制MDA-MB231细胞的生长,为进一步利用该系统用于肿瘤逆转治疗的研究奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 绪论
  • 1.1 课题来源及研究的目的和意义
  • 1.1.1 课题来源及研究目的
  • 1.1.2 课题意义
  • 1.2 胚胎微环境用于肿瘤治疗
  • 1.2.1 肿瘤治疗的现状
  • 1.2.2 胚胎发育的微环境对肿瘤细胞表型的逆转作用
  • 1.3 胚胎发育过程中逆转肿瘤的信号系统
  • 1.3.2 Nodal 信号的抑制因子lefty
  • 1.3.3 lefty 用于肿瘤治疗的主要问题
  • 1.4 海藻酸钠微囊缓释系统
  • 1.4.1 细胞微囊化技术
  • 1.4.2 细胞微囊化与肿瘤治疗
  • 1.5 本课题的主要研究内容
  • 第2章 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 质粒载体
  • 2.1.2 实验中相关引物及序列
  • 2.1.3 细胞系、菌种及实验动物
  • 2.1.4 主要试剂
  • 2.1.5 主要仪器及耗材
  • 2.1.6 主要分析软件
  • 2.1.7 培养基及其配制
  • 2.1.8 缓冲液及其他溶液的配制
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 Lefty1 重组体的构建
  • 2.2.2 Lefty2 重组体的构建
  • 2.2.3 细胞培养及转染
  • 2.2.4 蛋白获取及Lowry 法测蛋白浓度
  • 2.2.5 细胞蛋白Western Blotting 鉴定
  • 2.2.6 高压静电法制备海藻酸钠微囊
  • 2.2.7 ELISA 酶联免疫吸附试验
  • 2.3 本章小结
  • 第3章 分泌LEFTY 的HEK293 工程化细胞的构建
  • 3.1 引言
  • 3.2 稳定表达lefty-1 的HEK293 细胞株的构建
  • 3.2.1 Lefty1 重组体的构建
  • 3.2.2 pCDNA3.1-LEFTY1 质粒的稳定转染和lefty-1 蛋白表达验证
  • 3.3 稳定表达lefty-2 的HEK293 细胞株的构建
  • 3.3.1 Lefty2 重组体的构建
  • 3.3.2 pIRES-GFP-LEFTY2 重组体的细胞稳定转染
  • 3.4 讨论
  • 3.5 本章小结
  • 第4章 海藻酸钠微球的制备和用于包覆HEK293 细胞的研究
  • 4.1 引言
  • 4.2 高压静电法制备海藻酸钠微囊
  • 4.2.1 高压静电设备原理与制备
  • 4.2.2 电压对海藻酸盐微囊体直径影响
  • 4.2.3 明胶对海藻酸盐微囊体改性的研究
  • 4.3 海藻酸钠微囊包覆HEK293 细胞的研究
  • 4.3.1 微囊内HEK293 细胞活性研究
  • 4.3.2 微囊培养HEK293 细胞分泌lefty 的研究
  • 4.4 讨论
  • 4.5 本章小结
  • 第5章 海藻酸钠微球包覆HEK293 细胞用于肿瘤影响的初步研究
  • 5.1 引言
  • 5.2 微囊体外缓释lefty 的检测
  • 5.3 微囊系统体内缓释的初步研究
  • 5.4 微囊化细胞分泌lefty 对细胞增殖的影响
  • 5.5 讨论
  • 5.6 本章小结
  • 结论
  • 展望
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果
  • 致谢
  • 相关论文文献

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