论文摘要
葡萄霜霉病（Downy Mildew）是由葡萄霜霉病菌[Plasmopara viticola（Berk.et Curtis）Berl.et de Toni]引起的真菌性病害。危害几乎遍布全世界所有重要的葡萄栽区,是葡萄的重要病害之一。欧洲葡萄虽然品质好但不抗霜霉病,我国原产野葡萄华东葡萄（Vitispseudoreticulata W.T.WANG）“白河-35-1”株系,经多年研究证明对葡萄霜霉病表现出很强的抗病性。本研究以我国原产野葡萄华东葡萄“白河-35-1”株系为供试材料,接种葡萄霜霉病菌,采用SMARTTM技术构建中国野葡萄抗霜霉病基因cDNA文库。运用EST技术,通过序列分析,了解抗病野葡萄与葡萄霜霉病菌互作过程中表达的基因,为葡萄抗霜霉病育种研究提供有价值的抗病基因序列,为从分子水平研究葡萄霜霉菌入侵后寄主与病原菌抗性互作机理提供理论依据并奠定EST分析基础。1.采用改进的“SDS/酚”法提取接种后24h、48h、72h、96h的葡萄叶片总RNA,通过SMARTTM技术构建葡萄霜霉菌诱导的葡萄叶片cDNA文库。经检测,原始文库滴度为0.92×106pfu/mL,重组率97%,库容量约7.8×105,扩增文库滴度为5×109pfu/mL,插入片段在500～2200bp之间。2.随机挑取克隆,提取质粒,PCR检测插入片段大小。选取插入片段大于500bp且浓度＞30ng/μL,A260/280＞1.9,A260/230＞2.0的重组质粒进行5’端单向测序。将测序原始序列去除载体序列、重复序列及小于150bp的序列后,获得254条有效ESTs。所得ESTs中有27.06%的ESTs长度集中在500～600bp,所占比例最大;大于500bp的片段占64.17%,最长序列达964bp。3.获得254条质量良好的ESTs,并已登录GenBank数据库,登录号分别为:FG269201、FG269202、FG269203、FG269204、FG269205、FG269206、FG269207、FG269208、FG269209、FG269210、FG269211、FG269212、FG269213、FG269214、FG269215、FG269216、FG269217、FG269218、FG269219、FG269220、FG269221、FG269222、FG269223、FG269224、FG269225、FG269226、FG269227、FG269228、FG269229、FG269230、FG269231、FG269232、FG269233、FG269234、FG269235、FG269236、FG269237、FG269238、FG269239、FG269240、FG269241、FG269242、FG269243、FG269244、FG269245、FG269246、FG269247、FG269248、FG269249、FG269250、FG269251、FG269252、FG269253、FG269254、FG269255、FG269256、FG269257、FG269258、FG269259、FG269260、FG269261、FG269262、FG269263、FG269264、FG269265、FG269266、FG269267、FG269268、FG269269、FG269270、FG269271、FG269272、FG269273、FG269274、FG269275、FG269276、FG269277、FG269278、FG269279、FG269280、FG269281、FG269282、FG269283、FG269284、FG269285、FG269286、FG269287、FG269288、FG269289、FG269290、FG269291、FG269292、FG269293、FG269294、FG269295、FG269296、FG269297、FG269298、FG269299、FG269300、FG269301、FG269302、FG269303、FG269304、FG269305、FG269306、FG269307、FG269308、FG269309、FG269310、FG269311、FG269312、FG269313、FG269314、FG269315、FG269316、FG269317、FG269318、FG269319、FG269320、FG269321、FG269322、FG269323、FG269324、FG269325、FG269326、FG269327、FG269328、FG269329、FG269330、FG269331、FG269332、FG269333、FG269334、FG269335、FG269336、FG269337、FG269338、FG269339、FG269340、FG269341、FG269342、FG269343、FG269344、FG269345、FG269346、FG269347、FG269348、FG269349、FG269350、FG269351、FG269352、FG269353、FG269354、FG269355、FG269356、FG269357、FG269358、FG269359、FG269360、FG269361、FG269362、FG269363、FG269364、FG269365、FG269366、FG269367、FG269368、FG269369、FG269370、FG269371、FG269372、FG269373、FG269374、FG269375、FG269376、FG269377、FG269378、FG269379、FG269380、FG269381、FG269382、FG269383、FG269384、FG269385、FG269386、FG269387、FG269388、FG269389、FG269390、FG269391、FG269392、FG269393、FG269394、FG269395、FG269396、FG269397、FG269398、FG269399、FG269400、FG269401、FG269402、FG269403、FG269404、FG269305、FG269306、FG269307、FG269308、FG269309、FG269310、FG269311、FG269312、FG269313、FG269314、FG269315、FG269316、FG269317、FG269318、FG269319、FG269320、FG269321、FG269322、FG269323、FG269324、FG269325、FG269326、FG269327、FG269328、FG269329、FG269330、FG269331、FG269332、FG269333、FG269334、FG269335、FG269336、FG269337、FG269338、FG269339、FG269340、FG269341、FG269342、FG269343、FG269344、FG269345、FG269346、FG269347、FG269348、FG269449、FG369006、FG369007、FG369008、FG369009、FG3690104.通过BlastX分析,在获得的254条ESTs中有143条序列与功能已知基因相似性很高,占56.3%;37条与功能尚未确定的假设蛋白或未知蛋白同源性很高,占14.6%;53条在GenBank中尚无匹配的同源产物,占20.9%。在没有显著匹配的序列中很可能含有中国野葡萄所特有的抗病相关EST序列,需通过BlastN和dbEST数据库分析并进一步研究确定。5.蛋白功能预测分析表明,在此文库中有大量的低丰度表达基因,约占86%,说明文库的基因组成类型复杂。发现与已知功能基因高度同源的EST序列大致可以分为:18.88%抗病和防御、16.78%能量与代谢、13.99%转录调控、13.29%信号传导、11.19%蛋白质合成加工、4.89%蛋白质降解、4.89%细胞结构、4.20%转运、1.40%转座子以及10.49%无明确分类10类。我们下一步的任务是对有已知功能的序列进行进一步的深入研究,更重要的是对文库中大量的未知功能序列去验证,搞清其功能,为抗病育种的转基因研究提供有效的基因。