大肠杆菌表达重组人胰激肽原酶

论文摘要

胰激肽原酶（pancreatic kininogenase）是一种催化大分子前体物释放生物活性肽的酶。胰激肽原酶具有广泛的药用价值,除降血压之外,还可以用于治疗糖尿病、肾病、改善肾脏功能,治疗心、脑血管疾病等。本实验采用基因工程方法使人胰激肽原酶在大肠杆菌中得到高效表达,并研究其分离纯化工艺,得到重组人胰激肽原酶蛋白。由基因库查得人胰激肽原酶的基因序列,在序列前端添加肠激酶酶切位点,根据其氨基酸序列,采用大肠杆菌偏爱密码子设计合成基因750bp。PCR扩增目的基因,将得到的片断克隆于载体pGEM-T中并测序,再连接至表达载体pET-22b（+）中,重组质粒转入大肠杆菌Rosettatm （DE3）中。转化得到的重组大肠杆菌以IPTG诱导外源基因表达,经过SDS-PAGE电泳分析,在24KD处目标蛋白主要以包涵体形式存在。在37℃,pH为7.0时,以1.0mmol/L浓度的IPTG诱导6h,目的基因在大肠杆菌中的表达最佳,其在细胞总蛋白中含量可达52%。利用串联飞行时间质谱方式（MALDI-TOF-MS/MS）鉴定蛋白,通过MASCOT2.1数据检索引擎比对序列,检出三个片段,得分108分,在可信范围内,确定了蛋白质一级结构的正确性。包涵体经洗涤、变性、复性、透析,得到重组人胰激肽原酶粗品含量为1035mg/L.将粗品人胰激肽原酶与人工合成底物Nα—苯甲酰—L—精氨酸乙酯（BAEE）作用,底物发生了明显的降解,进一步验证了重组表达的正确性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 人胰激肽原酶简介
• 1.1.1 人组织激肽释放酶基因家族概述
• 1.1.2 人激肽释放酶的结构特点
• 1.1.3 KLK基因的生物学作用及相关机制
• 1.1.4 人激肽释放酶与疾病
• 1.2 激肽释放酶的生产方法
• 1.2.1 传统提取方法
• 1.2.2 基因工程的方法
• 1.3 大肠杆菌表达系统简介
• 1.3.1 外源基因
• 1.3.2 表达载体
• 1.3.3 表达宿主菌
• 1.4 重组蛋白的分离纯化技术
• 1.4.1 层析方法的选择
• 1.4.2 亲和层析
• 1.4.3 离子交换层析
• 1.4.4 凝胶过滤层析
• 1.4.5 其他方法
• 1.5 本课题的研究意义
• 第二章 人胰激肽原酶基因的克隆
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 引物设计及合成
• 2.3.2 PCR扩增
• 2.3.3 PCR产物回收（试剂盒）
• 2.3.4 连接
• 2法）'>2.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 2.3.6 细胞转化
• 2.3.7 质粒提取（碱裂解法）
• 2.3.8 酶切鉴定
• 2.3.9 基因测序鉴定
• 2.3.10 表达载体pET-22b-hpk的构建
• 2.4 结果分析与讨论
• 2.4.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.2 测序鉴定
• 2.4.3 表达载体pET-22b-hpk的构建
• 2.5 本章小结
• 第三章 人胰激肽原酶基因工程菌培养条件的优化
• 3.1 引言
• 3.2 试验材料与仪器
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 菌种活化
• 3.3.2 菌种培养
• 3.4 发酵过程各因素的影响
• 3.4.1 培养时间
• 3.4.2 诱导条件
• 3.5 分析方法
• 3.5.1 菌体浓度的测定
• 3.5.2 SDS-PAGE分析目标蛋白表达量
• 3.6 结果与讨论
• 3.6.1 基因工程菌的生长曲线
• 3.6.2 不同诱导条件对重组蛋白表达量的影响
• 3.7 小结
• 第四章 重组人胰激肽原酶的分离及活性测定
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料和仪器
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 重组人胰激肽原酶在大肠杆菌内的分布
• 4.3.2 重组人胰激肽原酶的分离纯化
• 4.3.3 MALDI-TOF-MS/MS鉴定人胰激肽原酶
• 4.4 分析方法
• 4.4.1 SDS-PAGE凝胶电泳
• 4.4.2 人胰激肽原酶活性的鉴定
• 4.5 结果与分析
• 4.5.1 重组人胰激肽原酶在菌体中的分布
• 4.5.2 重组人胰激肽原酶的粗分离
• 4.5.3 重组人胰激肽原酶的活性鉴定
• 4.5.4 MALDI-TOF-MS/MS鉴定人胰激肽原酶
• 4.6 小结
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 附录
• 附录一 各种试剂的配制
• 附录二 培养基
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 作者和导师简介
• 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书