几种草坪草转基因及体细胞无性系变异的研究

论文题目: 几种草坪草转基因及体细胞无性系变异的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物遗传育种

作者: 张磊

导师: 马传喜

关键词: 日本结缕草,黄叶高羊茅,体细胞无性系变异,再生体系,农杆菌,遗传转化

文献来源: 安徽农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本试验以成熟种子为试材,优化了日本结缕草愈伤组织诱导及分化再生及农杆菌介导遗传转化的关键因子,在此基础上进行了 bt 基因转化日本结缕草的研究;在建立了高羊茅高效再生体系的基础上,将体细胞无性系变异技术与诱变技术相结合进行了高羊茅优质突变体的研究。结果如下: 1)以破除休眠的日本结缕草和高羊茅成熟种子为外植体,通过单因素和多因素试验确定了两种草坪草愈伤组织诱导、继代和分化的最佳培养基。结果表明,日本结缕草愈伤组织的诱导培养基为含 2,4-D 1 mg/L+NAA 3mg/L 的 MS 培养基;继代培养基为含2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L 的 MS 培养基;分化培养基为含 6-BA 3 mg/L+KT 3.5mg/L 的 MS 培养基;生根培养基为含 NAA 0.3mg/L 的 MS 培养基。高羊茅愈伤组织的诱导培养基为含 2,4-D 5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L 的 MS 培养基;分化培养基为含 6-BA 3mg/L 的 MS 培养基;生根培养基为不含激素的 1/2MS 培养基。以上所有固体培养基中均添加 30g/L 的蔗糖和 3g/L 的 phytagel。 2)将获得的胚性愈伤组织进行γ辐照处理,经再生后获得了一批日本结缕草和高羊茅的叶形、叶色、株高等突变体。对其中的黄叶高羊茅种子后代进行空间技术处理。结果表明,空间技术引起的 SP1生理损伤较轻,SP2未发现叶绿体缺失突变,但株叶形态、熟期和耐热性变异丰富,从中筛选、鉴定了半矮秆、匍匐性、细叶、迟熟、耐热性等优质抗逆黄叶高羊茅突变体。 3)以 gus 基因瞬时表达为指标,对农杆菌介导日本结缕草成熟种子诱导的愈伤组织转化体系及其影响因子进行了系统性研究。结果表明,获得最佳转化效率的条件为:取继代培养 2 周的胚性愈伤组织于添加 100μmol/L AS 的培养基上预培养 3-5d;感染前24h 进行 2Gy 辐照处理,再接种于预培养基上; OD600 值为 0.2 的菌液感染 5min,于注射器中抽拉 20 次;感染后于光照或 16h 光照、22℃条件下共培养 3d;选择培养间隔以 7-10d 为宜。研究了不同抗生素的抑菌效果和日本结缕草愈伤组织的本底耐受性。结果表明,250-500mg/L 的羧苄青霉素可以较好地抑制农杆菌的生长。日本结缕草对潮霉素比卡那霉素更敏感,将愈伤组织接种于含潮霉素 200mg/L 的诱导培养基上,两周后愈伤组织褐化死亡率超过 90%。

论文目录:

第一章文献综述

1 植物遗传转化研究进展

1.1 植物转基因的基本方法及其特点

1.1.1 基因枪转化法

1.1.2 电击法

1.1.3 PEG 介导法

1.1.4 激光微束法

1.1.5 农杆菌介导法

1.2 农杆菌介导植物转基因研究进展

1.2.1 农杆菌介导植物转基因机理及特点

2 草坪草生物技术研究进展及热点

2.1 转基因草坪草研究进展

2.1.1 结缕草遗传转化研究进展

2.1.1.1 结缕草的离体再生

2.1.1.2 结缕草的遗传转化

2.1.2 高羊茅遗传转化研究进展

2.1.2.1 再生体系的建立

2.1.2.2 羊茅属的遗传转化

2.1.3 其他草坪草转基因研究进展

2.1.3.1 外植体的选用

2.1.3.2 转化方法

2.1.3.3 选择标记及其浓度

2.2 草坪草的蛋白质和分子标记研究

2.2.1 蛋白质标记

2.2.2 DNA 分子标记

2.3 体细胞无性系变异技术在草坪草育种中的应用

3 草坪草的研究热点及展望

3.1 优质抗逆草坪草

3.2 抗病虫与环保型草坪草

3.3 纯天然彩色草坪草

3.4 核技术在草坪草改良中的潜在应用价值

引言

第二章日本结缕草与高羊茅高效再生体系的建立

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 方法

1.2.1 日本结缕草种子休眠的破除

1.2.2 种子发芽实验

1.2.3 日本结缕草愈伤组织的诱导、继代及分化

1.2.4 高羊茅愈伤组织的诱导及分化

2 结果与分析

2.1 日本结缕草种子休眠的解除

2.2 不同激素及其组合对日本结缕草愈伤组织诱导的影响

2.3 激素6-BA 与 KT 对日本结缕草愈伤组织分化的影响

2.4 高羊茅再生体系条件的优化

3 讨论

第三章日本结缕草和高羊茅优质突变体的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 日本结缕草及高羊茅愈伤诱导、辐照及再生

1.2.2 空间处理

1.2.3 SP1生物学效应和 SP2的早熟和变异分析

2.2.4 突变深入鉴定及坪用性状评价

2 结果与分析

2.1 体细胞无性系变异结合γ射线辐照获得不同性状突变体

2.2 空间技术处理黄叶高羊茅的 SP1生物学效应

2.3 SP2突变

2.3.1 叶绿素缺失突变

2.3.2 株、叶形态和熟期突变

2.3.3 耐热性变异

2.3.4 突变性状的遗传稳定性

3 讨论

第四章农杆菌介导日本结缕草高效转化体系的建立

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 日本结缕草种子休眠的破除，胚性愈伤组织的诱导及继代

1.3 抗生素、选择试剂及其浓度设置

1.4 抗生素的抑菌试验

1.5 植物组织对选择标记的本底耐受性试验

1.6 转化方法的比较试验

1.7 辐照对转化的影响

1.8 负压处理对转化的影响

1.9 GUS 组织化学染色

1.10 培养基

1.10.1 农杆菌培养基

1.10.2 植物转化用培养基

2 结果与分析

2.1 抗生素的抑菌效果

2.2 植物材料对抗生素的本底耐受性

2.3 转化方法对转化频率的影响

2.3.1 添加 AS 对转化频率的影响

2.3.2 感染时间对gus 基因瞬时表达频率的影响

2.3.3 共培养温度对gus 基因瞬时表达频率的影响

2.3.4 共培养天数对gus 基因瞬时表达频率的影响

2.3.5 菌液浓度对转化频率的影响

2.3.6 光照条件对转化频率的影响

2.3.7 预培养时间对转化频率的影响

2.3.8 继代时间对转化频率的影响

2.4 辐照处理对转化的影响

2.4.1 辐照对愈伤组织转化的影响

2.4.2 辐照对存活率的影响

2.4.3 辐照后培养时间对愈伤组织转化的影响

2.5 负压处理对转化的影响

3 讨论

第五章农杆菌介导日本结缕草转bt 基因植株的获得

1 材料与方法

1.1 试验材料与准备

1.2 农杆菌菌株与质粒

1.3 方法

1.3.1 农杆菌介导日本结缕草胚性愈伤的转化方法和转化体的筛选与再生

1.3.2 GUS 组织化学染色法

1.3.3 日本结缕草 DNA 提取

1.3.4 PCR 检测

1.3.5 Southern 杂交

1.3.6 cry1A（b）基因表达产物的定量

2 结果与分析

2.1 转化体筛选体系的优化和抗性再生植株的获得

2.1.1 共培养后的筛选策略对抗性愈伤率的影响

2.1.2 分化培养基组分对植株再生的影响

2.1.3 潮霉素抗性再生日本结缕草植株的获得

2.2 潮霉素抗性日本结缕草植株的 GUS 组织化学染色

2.3 PCR 分析

2.4 转基因植株的Southern blot分析

2.5 转基因植株中 Bt 蛋白含量测定结果

3 讨论

结论

参考文献

致谢

个人简介

在读期间发表的论文

发布时间: 2005-07-28

参考文献

[1].日本结楼草（Zoysia japonica Steud.）植株再生体系建立与DREB1A基因转化研究[D]. 齐春辉.北京林业大学2005
[2].日本结缕草（Zoysia japonica Steud.）悬浮再生体系的建立与超低温保存研究[D]. 方文娟.北京林业大学2008
[3].GA3调控日本结缕草叶片衰老过程相关基因的分离与初步功能分析[D]. 程晓霞.北京林业大学2010
[4].日本结缕草IPT基因遗传转化及野牛草实生群体内遗传多样性研究[D]. 刘莉.华中农业大学2010
[5].结缕草温度胁迫的生理响应及其分子机制研究[D]. 黄锦文.福建农林大学2009
[6].两种暖季型草坪草对低温的响应机制及ZjADH基因的克隆与功能分析[D]. 梁小红.北京林业大学2016

几种草坪草转基因及体细胞无性系变异的研究

猜你喜欢