未培养微生物来源的纤维素酶功能基因的筛选

论文摘要

纤维素是由吡喃型D-葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的直链状大分子,是地球上含量最丰富的生物质资源。随着社会经济的发展,生物质资源的利用越来越受到人们的重视。在自然界中,有很多微生物都能产生将纤维素降解转化为葡萄糖的纤维素酶,而葡萄糖可以进一步作为发酵生产包括乙醇在内的化学基产品原料;同时,纤维素酶在饲料添加剂,纺织,造纸等行业也有着广阔的应用前景。但是,已知的纤维素酶普遍存在着活力不高,效率较低,发酵生产成本比较高的缺点,限制了纤维素酶的大规模工业化应用。因此,有必要筛选新型高效纤维素酶。目前,通过传统的微生物筛选方法所获得的产纤维素酶菌株大多为已知菌种,筛选到新菌种的几率很低。另一方面,在自然界中存在着大量的未培养微生物（＞99%）,而某些特殊生境的微生物有可能产生高效降解纤维素的酶或酶系。通过提取并纯化特定环境样品中微生物的总DNA,进而构建环境基因组文库,并从构建的各种基因组文库中筛选新的纤维素酶基因,为纤维素酶的筛选提供了一条新的筛选途径。本论文以λ噬菌体（Stratagene）为载体成功构建了四川九寨沟森林土壤、东营市某屠宰厂的牛瘤胃液、济南市动物园亚洲象的新鲜排泄物以及取自新疆喀纳斯的腐烂木材等环境的基因组文库,文库分析发现其外源插入DNA片段有很好的随机性,文库的容量达到了实验筛选的需求。通过相关纤维素酶活性筛选的方法对所构建文库进行了初步筛选,得到了5个新的内切纤维素酶基因和2个新的β-葡萄糖苷酶基因。基因序列显示,它们与GenBank中已知的纤维素基因不仅在核苷酸水平上没有明显的同源性,而且其编码产物与已知的纤维素酶在氨基酸水平上的一致性低于50%,相似性低于70%,说明筛选到的纤维素酶基因为新的纤维素基因,证明了环境基因组学研究方法在筛选新纤维素酶基因,尤其是未培养微生物来源的纤维素酶方面的可行性。同时,研究结果也表明相关的纤维素酶系广泛存在于诸如森林土壤、牛瘤胃液及大象排泄物等环境中。对所分离纤维素酶的氨基酸序列进一步分析表明,其中四个内切纤维素酶属于糖苷水解酶第5家族,另一个内切纤维素酶属于糖苷水解酶第9家族,但它们只含有相应家族糖苷水解酶的催化结构域,而不包含CBM区,推测原因可能是含有CBM区的纤维素酶基因不能在大肠杆菌体系中正确地折叠表达,因而无法用活性筛选的方法得到这些基因。所筛选获得的两个β-葡萄糖苷酶均属于糖苷水解酶第3家族,它们均含有糖苷水解酶3C功能域和糖苷水解酶3功能域。遗传进化树分析结果表明,这些纤维素酶与所属家族的纤维素酶处于相邻的分支上。但对这些纤维素酶粗酶液的初步分析结果显示,与同家族的已知纤维素酶相比,目前尚未发现其存在某些特殊的催化特性。总之,本论文成功构建了多个环境样品的基因组文库,并从中筛选克隆到了新的纤维素酶基因,相关结果验证了环境基因组学研究方法在筛选新纤维素酶基因,尤其是未培养微生物来源的纤维素酶方面的可行性,为进一步的大规模筛选奠定了基础;论文所建立的方法也可以用于通过环境基因组学的方法筛选其它活性产物的工作。同时,论文工作也预示了环境基因组学功能活性筛选与其它分析方法相结合在阐述复杂生境催化体系中结构组成及其变化中的重要性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词（Abbreviation）
• 第一章 前言
• 1.1 纤维素酶
• 1.2 纤维素酶研究及实际应用中存在的问题
• 1.3 未培养微生物的研究
• 1.3.1 环境基因组的构建
• 1.3.2 从环境样品中提取并纯化微生物群体基因组
• 1.3.3 环境基因组文库的构建
• 1.3.4 环境基因组学的相关分析方法及策略
• 1.4 本研究目的
• 第二章 环境样品中微生物的总DNA提取纯化
• 2.1 实验材料、方法
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 实验方法
• 2.1.3.1 环境样品总DNA的提取
• 2.1.3.2 环境样品总DNA的纯化
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 环境样品总DNA的提取
• 2.2.2 环境样品总DNA的纯化
• 2.3 小结
• 第三章 环境基因组文库的构建及分析
• 3.1 材料方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 方法
• 3.1.4.1 Sau3A Ⅰ酶切条件的优化
• 3.1.4.2 回收2-10Kb范围内的DNA片段
• 3.1.4.3 牛瘤胃液基因组文库的构建
• 3.1.4.4 构建的基因组文库的评价及文库容量
• 3.1.4.5 基因组文库的扩增
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 Sau3A Ⅰ酶切条件的优化
• 3.2.2 2-10 Kb DNA片段的回收
• 3.2.3 基因组文库的构建及质量评价
• 3.3 本章小结
• 第四章 基因组文库的活性筛选
• 4.1 材料方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 方法
• 4.1.4.1 内切纤维素酶活性的筛选
• 4.1.4.2 β-葡萄糖苷酶活性的筛选
• 4.1.4.3 活性克隆的鉴定
• 4.1.4.4 内切葡聚糖酶酶活的测定
• 4.1.4.5 β-葡萄糖苷酶活力的测定
• 4.2 结果
• 4.2.1 基因组文库的筛选
• 4.2.1.1 内切葡聚糖酶活性克隆的筛选
• 4.2.1.2 β-葡萄糖苷酶活性克隆的筛选
• 4.2.2 活性克隆的鉴定
• 4.2.2.1 活性克隆诱导粗酶液酶活的测定
• 4.2.2.2 活性克隆诱导粗酶液的平板验证
• 4.3 小结
• 第五章 纤维素酶基因的测序及序列分析
• 5.1 序列测定及分析
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 β-葡萄糖苷酶基因的克隆和序列分析
• 5.2.1.1 β-葡萄糖苷酶基因Umcel3s1序列分析
• 5.2.1.2 β-葡萄糖苷酶基因Umcel3c1序列分析
• 5.2.2 内切纤维素酶基因的序列分析
• 5.2.2.1 内切纤维素酶基因Umcel5s1的分析
• 5.2.2.2 内切纤维素酶基因Umcel5c1的序列分析
• 5.2.2.3 内切纤维素酶基因Umcel5c2的序列分析
• 5.2.2.4 内切纤维素酶基因Umcel9e1的序列分析
• 5.2.2.5 内切纤维素酶基因Umcel5e2的序列分析
• 5.2.3 筛选到的未培养微生物纤维素酶的遗传进化树分析
• 5.3 小结
• 第六章 筛选获得的纤维素酶酶学性质的初步分析
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 菌株
• 6.1.2 试剂
• 6.1.3 仪器
• 6.1.4 方法
• 6.1.4.1 SDS-PAGE蛋白质电泳
• 6.1.4.2 活性染色
• 6.1.4.3 活性克隆的初步酶学特性分析
• 6.1.4.3.1 酶的最适pH值的测定
• 6.1.4.3.2 酶的最适反应温度的测定
• 6.1.4.3.3 酶pH耐受性测定
• 6.1.4.3.4 酶热稳定性测定
• 6.2 结果和讨论
• 6.2.1 活性克隆的粗酶液的活性分析
• 6.2.2 β-葡萄糖苷酶Umcel3c1酶学特性初步分析
• 6.2.2.1 pH值对Umcel3c1酶活力的影响
• 6.2.2.2 反应温度对Umcel3c1酶活力的影响
• 6.2.2.3 pH值对Umcel3c1的稳定性影响
• 6.2.2.4 温度对Umcel3c1稳定性的影响
• 6.2.3 内切纤维素酶Umcel5s1酶学性质的初步研究
• 6.2.3.1 反应温度对Umcel5s1酶活力的影响
• 6.2.3.2 pH值对Umcel5s1酶活力的影响
• 6.2.3.3 温度对Umcel5s1酶活力稳定性的影响
• 6.2.3.4 pH值对Umcel5s1的稳定性影响
• 6.3 小结
• 工作总结和展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表